两种食品防腐剂与牛血清白蛋白相互作用

李 田，程正军，曹丽君，蒋晓慧

(西华师范大学 a．化学化工学院;b．四川省化学合成与污染控制重点实验室，四川 南充 637009)

纳他霉素(natamycin)和乳酸链球菌素(nisin)是常用的食品防腐剂． 例如，Ollé Resa 等［1］报道含有natamycin 的可食性木薯淀粉比直接将它喷洒到奶酪表面对奶酪的防腐效果好． 最近，Zhang 等［2］的研究表明含有nisin 的D-柠檬烯纳米乳剂对4 种食品表面上微生物的防腐效果更好． 此外，Kallinteri 等［3］调查了natamycin 与nisin 混合对Galotyri 奶酪保质期的影响，结果发现直接加入natamycin 或它与nisin 混合对这种奶酪的保质期均比只用nisin 的长． 但是它们对人体健康具有潜在的危害，如natamycin 能引发姐妹染色单体交换、染色体变异和人淋巴细胞中微核的形成［4］． natamycin/nisin 与蛋白质的相互作用知识对理解natamycin/nisin 的毒理性、特异性、转移运输和新陈代谢至关重要． 到目前为止，natamycin/nisin 与蛋白质的相互作用特性仍然未知． 因此，研究蛋白质与natamycin/nisin 间的相互作用具有重要意义．

在血液循环系统中，血清白蛋白是主要的可溶性蛋白质，在转移一些有机和无机化合物包括金属离子方面扮演重要的角色． 在血清白蛋白中，牛血清白蛋白(BSA)已被广泛用作一个模型来评估蛋白质与有机小分子间的相互作用，因为它与人血清白蛋白的结构相似度高达76%［5］．在本文中，采用多光谱技术(荧光、三维荧光、UV-vis 吸收和FTIR 光谱)探讨了natamycin/nisin 与BSA 的结合特性(如:BSA-natamycin/nisin 体系的荧光猝灭机理，结合位点数，结合力，等)． 此外，几种常用离子对这两个绑定反应的影响也被调查．

1 材料与方法

1．1 材 料

BSA (纯度98%，M=68 000)购于罗氏公司，且使用前没有进一步纯化;BSA 的溶液在0．05M 的磷酸缓冲液中制备． Natamycin (99%纯度)和nisin (99%纯度)分别购于阿拉丁化学有限公司和上海乐香生物有限公司． 其它化学药品均为分析纯，无需进一步纯化，所有溶液保存在4℃． 整个实验过程中使用的水均为二次蒸馏水．

1．2 方 法

所有荧光光谱均在Cary Eclipse 荧光分光光度计(Varian，USA)上测量，且该仪器配有电子恒温装置．固定BSA 的浓度为5．0μM，natamycin/nisin 的浓度从0 逐渐增加到85．71/375．00μM． 激发和发射狭缝宽度均设为5nm，激发波长设为280nm，通过荧光滴定实验测定四个温度下250 -500nm 波长范围内的荧光光谱，所有荧光滴定实验均用50μL 微量进样器手动完成． 此外，记录250 -350nm 波长范围内Δλ = 15 和60nm的同步荧光光谱数据，而扫描同步荧光光谱的仪器参数设置与荧光猝灭光谱相同．

三维荧光光谱的扫描速度为24 000nm/min，激发波长在200 -350nm 范围内变化，步长为2nm，且在每个激发波长下记录200 -500nm 波长范围内的三维荧光数据．

Natamycin/nisin 与BSA 间的位点竞争实验在3 种位点标记物(phenylbutazone，flufenamic 和digitoxin)存在下用荧光滴定方法完成． 把BSA 与位点标记物分别加入试管中(它们的浓度均为5．0μM，pH=7．4)，然后把natamycin/nisin 溶液逐渐滴加到BSA-phenylbutazone，BSA-flufenamic，或BSA-digitoxin 混合物中，记录250 -500nm 范围内的荧光数据．

紫外可见吸收光谱在UV-3600 紫外-可见-近红外光度计上测量． 红外光谱在Nicolet-6700 FTIR 上通过衰减全反射测定，测量范围是400 -4 000 cm-1，BSA 与natamycin/nisin 的摩尔比分别为1∶1 和1∶3． 扣除缓冲液和natamycin/nisin 溶液的吸光度值．

2 结果与讨论

2．1 Natamycin/nisin 对BSA 的荧光猝灭

在不同浓度natamycin/nisin 的存在下，BSA 的荧光光谱见图1． 如图1 所示，BSA 的荧光强度随natamycin/nisin 加入量增加而逐渐降低，且它的最大发射波长没有发生移动． 该结果表明BSA 与natamycin/nisin间存在相互作用，但是这种相互作用没有引发BSA 的变性．

图1 不同浓度natamycin (a)和nisin (b)与BSA 作用的荧光猝灭光谱图Fi g.1 Fluorescence quenching spectra of BSA by natamycin (a) and nisin (b)

荧光猝灭机理通常分为动态猝灭和静态猝灭． 动态猝灭是荧光团和猝灭剂之间碰撞的结果，而静态猝灭归于荧光团和猝灭剂间形成基态复合物． 荧光猝灭机理可以运用KSV(Stern-Volmer 猝灭常数)值随温度变化趋势来判别，即若KSV值随着温度上升而下降则为静态猝灭，反之则为动态猝灭［6］． 为了得到BSA-natamycin/nisin 体系的猝灭机理，对应的荧光光谱数据用Stern-Volmer 方程分析:

其中F0和F 是BSA 在加入猝灭剂前后的荧光强度;KSV、Kq和［Q］分别代表Stern-Volmer 猝灭常数、猝灭速率常数和猝灭剂浓度;τ0是不存在猝灭剂下蛋白质的平均寿命，生物高聚物的荧光寿命为10-8s． 通过F0/F对［Q］线性拟合图的斜率计算KSV值，对应的值列于表1． 从表1 中的数据可知，BSA-natamycin 和BSA-nisin的KSV值与温度成负和正相关，表明natamycin 和nisin 与BSA 的猝灭机理是静态和动态猝灭机理． 但是在BSA-nisin 复合物中，静态猝灭也不能完全排除，因为它的Kq值远大于生物分子的最大猝灭常数2．0 ×1010L·mol-1·s-1［7］． 此外，为了进一步探索这两个绑定反应能形成复合物，分别测量BSA-natamycin/nisin 体系的共振光散射光谱(图没有列出)，BSA 的共振光散射强度随着natamycin/nisin 浓度增大而逐渐增强，充分说明相互作用过程中确实形成BSA-natamycin/nisin 复合物． 此结果再次证明BSA 与natamycin/nisin 间属于静态猝灭．

表1 在四个不同温度下，BSA-natamycin/nisin 体系的Stern-Volmer 参数Tab．1 The parameters for the BSA-natamycin/nisin system at four temperatures

表2 在不同温度下，BSA-natamycin/nisin 体系的结合常数Kb、结合位点数n 和热力学参数Tab． 2 The binding constants Kb，the number of binding sites n，and the thermodynamic parameters of BSA-natamycin/nisin system at different temperatures

2．2 BSA 与natamycin/nisin 间的结合常数和结合位点数

对一个静态猝灭相互作用，假设猝灭过程中有独立的结合位点，那么结合常数(Kb)和结合位点数(n)可以根据式(2)计算:

其中Kb是BSA 与natamycin/nisin 间的结合常数，n 是猝灭剂在蛋白分子上的结合位点数． 不同温度下的Kb值和n 值可根据双对数拟合直线(式(2))的截距和斜率来估算，结果列于表2．从表2 中数据可以看出，相对其它结合亲和力强的蛋白质-配体复合物的结合常数(106-108M-1)［8］，它们的结合常数值比较低． 且BSA-natamycin 体系的Kb值比BSA-nisin 的Kb值更大，表明BSA 与natamycin 结合比它与nisin 结合力更强．不同温度下的n 值都接近1，暗示BSA 与natamycin/nisin 间的相互作用有一个结合位点，并且natamycin/nisin 很可能结合到BSA 子域IIA 的疏水腔中，也就是Trp-212．

为了进一步确定natamycin/nisin 在BSA 上的结合位置，进行结合位点取代实验． 根据前人研究结果，Phenylbutazone(PB)和warfarin(WF)绑定位点I，ibuprofen(IP)和flufenamic(FA)绑定位点II，digitoxin(DIG)绑定位点III［9］． 因此在本研究中，我们选取3 个不同结合位点的探针(PB、FA 和DIG)，分别将natamycin/nisin 溶液滴加到BSA 与不同位点标记物(BSA 与位点标记物的摩尔比均为1∶1)的混合液中，并用式(2)分析它们对应的荧光猝灭数据． BSA-natamycin/nisin-PB 体系的Kb值远小于BSA-natamycin/nisin 体系的Kb值(表3)，然而，BSA-natamycin/nisin 体系中加与不加FA/DIG 标记物，它们的Kb值没有明显变化． 上述结果表明natamycin/nisin 主要与BSA 位点I(子域IIA)中的Trp-212 结合．

表3 不同位点标记物对BSA-natamycin/nisin 体系结合常数的影响Tab．3 Effects of the site probe on the binding constants of natamycin/nisin to BSA

2．3 BSA 与natamycin/nisin 间的热力学参数

有机小分子与生物大分子间的相互作用力主要包括氢键、疏水性作用、静电作用和范德华力．而热力学参数(ΔH、ΔS 和ΔG)大小和符号能判定绑定过程中存在的主要结合力类型，这些热力学参数通过范特霍夫方程计算［10］，它们对应的值列于表2． 负的ΔG 值表明BSA-natamycin/nisin 复合物的形成是自发过程． 正的ΔH 和ΔS 值暗示BSA 与natamycin 形成复合物通过疏水性相互作用． 然而，对BSA-nisin 体系，ΔH 和ΔS 都为负值，说明BSA-nisin 复合物形成主要通过氢键和范德华力［11］．

2．4 BSA 与natamycin/nisin 间的结合距离

图2 BSA 荧光发射光谱(a)与natamycin (b)和nisin (c)紫外可见吸收光谱的重叠图Fig．2 Spectral overlap of the UV-vis absorption spectra of natamycin (A) and nisin (B)with the fluorescence emission spectrum of BSA

能量共振转移由供体的荧光发射光谱和受体的吸收光谱相互重叠产生(图2)． 根据福斯特非辐射能量转移理论，结合距离r 可用以下公式推出［12］:

对BSA，K2= 2/3、N = 1．36 和Φ= 0．15，根据公式(3)-(5)，计算结果如下:对BSA-natamycin 体系，J= 5．55 ×10-17cm3·L·mol-1，R0= 1．06nm，r = 1．36nm，E = 18．53%;对BSA-nisin 体系，J = 3．73 ×10-16cm3·L·mol-1，R0= 1．46nm，r= 2．06nm，E= 11．16%．结果表明供体和受体间的距离均小于8nm，再次证明BSA 与natamycin/nisin 间的作用是静态猝灭． 且BSA-natamycin 的结合距离比BSA-nisin 短，说明BSA-natamycin 间的能量转移效率比BSA-nisin 高．

2．5 Natamycin/nisin 对BSA 构象的影响

为了探索natamycin/nisin 对BSA 构象的影响，我们分析BSA 加入natamycin/nisin 前和后的紫外可见吸收、同步荧光、三维荧光和红外光谱．

2．5．1 UV-vis 吸收光谱

UV-vis 吸收光谱是一种简单、普通和有效的方法对探测蛋白质结构变化和复合物的形成． BSA 的吸收光谱强度随natamycin/nisin 浓度增大而逐渐上升(图未列出)，表明BSA 与natamycin/nisin 间形成复合物，且natamycin/nisin 加入导致BSA 的构象变化．

2．5．2 同步荧光光谱

同步荧光光谱能有效评估蛋白质的微环境变化，而该方法在设置一个固定的波长差(Δλ = λem-λex)后，同步扫描激发和发射单色器．最大发射波长位置移动表明荧光团周围极性发生变化． 当Δλ 为15 和60 nm 时，同步荧光分别提供酪氨酸和色氨酸残基的特性． 在不同natamycin/nisin 浓度存在下，BSA 的酪氨酸和色氨酸残基荧光光谱对应的最大发射波长没有明显位移(图未给出)，表明加入natamycin/nisin 后，这两种氨基酸残基的微环境没有发生明显的变化． 但是Δλ = 60 nm 的荧光猝灭强度比Δ λ = 15 nm 大，表明色氨酸残基固有荧光的猝灭比酪氨酸残基强，故natamycin/nisin 更靠近色氨酸残基，即结合位点主要位于色氨酸残基［13］． 该结果与结合位点竞争实验结论相一致．

2．5．3 三维荧光光谱

三维荧光光谱通过同时改变激发和发射波长探索蛋白质的构象变化，它能提供关于荧光特性的所有信息，所以它是一种有效的方法对蛋白质构象变化的研究． 在三维荧光光谱图中，若荧光峰的激发或发射波长发生移动，一个新峰出现，或一个存在的峰消失，都表明蛋白质的构象发生变化． 通过比较BSA 的三维荧光光谱变化(图3)，我们发现在natamycin/nisin 存在下，BSA 中峰I(色氨酸和酪氨酸残基的光谱特性)和峰II(多肽骨架结构特性)的荧光强度均降低;此外，对BSA-nisin 体系，峰I 的最大发射波长轻微红移(从340 -345nm)． 上述分析表明加入这两种防腐剂后导致BSA 的结构变化．

2．5．4 红外光谱

BSA 与natamycin/nisin 作用的光谱特性可通过红外光谱方法来描述． 酰胺I 带(1 700 -1 600 cm-1)归于C=O 伸缩振动，酰胺II 带(1 600 -1 480 cm-1)对应于N-H 弯曲和C-N 伸缩［14］． 记录存在与不存在natamycin/nisin 下BSA 的红外光谱和对应的差谱(图未给出)．

当BSA 与natamycin/nisin 的摩尔比率为1∶1 时，峰I 和峰II 带在1 652cm-1和1 545cm-1处，而在对应的差谱中，正的峰I 和峰II 在1 646 和1 548cm-1(natamycin)，1 648 和1 547cm-1(nisin)，且峰I 和峰II 的强度增强归因于natamycin/nisin 与蛋白质中C=O、C-N 和N-H 结合． 然而，当BSA 与natamycin/nisin 的摩尔比率降低到1 ∶3 时，在它们差谱中观察到负的特征峰在1 652 和1 546cm-1(natamycin)，1 651 和1 548cm-1(nisin)． 对BSA-natamycin/nisin 复合物，1 652cm-1处的峰I 带强度下降，表明在高natamycin/nisin浓度下，BSA 的α-螺旋含量降低．

2．6 共存离子对相互作用的影响

一些常见离子(如:Cu2+、NH4+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、K+、Mg2+、Cl-、CH3COO-和C5H7O5COO-)对人体非常重要归因于它们能参与一些生理作用过程，所以我们讨论几种常见离子对natamycin/nisin 绑定BSA的影响． 结果表明对BSA-natamycin 体系，加入上述任何一种离子，该体系的猝灭常数均减少;对BSA-nisin体系，分别加入四种离子(Ca2+、Fe3+、K+和Mg2+)后，其猝灭常数均下降;这可能是共存离子与natamycin/nisin 竞争BSA 上相同的结合位点所致． 然而，对BSA-nisin 体系，在Cu2+、NH4+、Zn2+、Cl-、CH3COO-或C5H7O5COO-存在下，对应的猝灭常数值均增大，可能是因为金属离子与nisin 间通过金属键形成复合物，促进nisin 与BSA 的结合，或因为这六种离子改变BSA 的构象，从而导致BSA-nisin 复合物形成更容易在这六种离子存在下． 因此，这些常见离子在血液中可能会延长(使猝灭常数减小的离子)或缩短(使猝灭常数增大的离子)食品防腐剂(natamycin 或nisin)的储存时间． 基于上述分析，在这些常见离子存在下，为了使防腐剂对食品有更好的防腐效果，及时调整它们的剂量是必要的．

图3 BSA(a)、BSA-natamycin(b)和BSA-nisin (c)的三维荧光光谱图Fig.3 3D fluorescence spectra of BSA (a), BSA-natamycin (b), and BSA-nisin (c)

3 结 论

作者研究在四种不同温度下BSA 与natamycin/nisin 间的结合特性． BSA-natamycin 和BSA-nisin 复合物的结合距离分别为1．36 和2．06 nm，说明BSA-natamycin 间的能量转移效率比BSA-nisin 高． 热力学参数表明这两个结合反应均能自发进行． natamycin/nisin 最可能绑定BSA 子域IIA 中的Trp-212 残基． UV-vis 吸收、同步荧光、三维荧光和FTIR 光谱结果表明natamycin/nisin 能改变BSA 的构象． Cu2+、NH4+、Zn2+、Cl-、CH3COO-或C5H7O5COO-离子的加入导致BSA-nisin 复合物的猝灭常数增大;而对BSA-natamycin 复合物，上述离子使它的猝灭常数均减小． 这些研究将有助于理解natamycin/nisin 在人体内的转移、吸收、新陈代谢和毒性，并且确定它们在食品中的剂量．

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