二代测序技术检测早期自然流产胚胎染色体异常

刘丽，徐凤琴，邸建永，刘清华，李毅

二代测序技术检测早期自然流产胚胎染色体异常

刘丽，徐凤琴，邸建永，刘清华，李毅△

目的探讨二代测序（NGS）技术检测早期自然流产（SA）绒毛组织染色体异常的价值。方法选择自然流产患者87例，其中复发性流产32例，偶发性流产55例。年龄≥35岁组35例，＜35岁组52例。取其流产绒毛组织，行NGS全基因组测序及G显带染色体核型分析，比较2种方法的检测成功率和异常检出率，比较不同流产类型及不同年龄患者的流产组织染色体异常率。结果NGS技术检测流产绒毛组织的成功率（100.00%）高于G显带核型（74.71%），异常检出率（58.62%）也高于G显带核型（50.77%）。NGS检测的51例异常中染色体结构异常3例（5.88%），染色体数目异常48例（94.12%），其中三体39例，双重三体2例，三重三体1例，单体6例。G显带核型分析检出的33例异常中染色体数目异常32例，其中三体24例，双重三体2例，三重三体1例，单体5例；染色体结构异常1例。NGS与G显带核型分析测序结果相符64例，不符1例。NGS技术检测偶发性流产与复发性流产组织染色体异常率分别是60.00%和56.25%，差异无统计学意义。≥35岁组的染色体异常率（71.43%）高于＜35岁组（50.00%），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论NGS技术检测染色体异常的分辨率好，准确度高，有助于明确SA的病因，指导患者再次妊娠及优生优育。

二代测序技术；染色体畸变；流产，自然；绒毛膜绒毛；G显带核型；遗传

自然流产（spontaneous abortion，SA）在妊娠中的发生率为10%～15%［1］。孕12周之前的流产称为早期SA。与同一配偶发生连续2次或多次SA称为复发性流产。早期SA的病因复杂，50%以上的胚胎是由染色体异常造成的［2］。发生SA时的孕周越短，染色体异常的可能性越大。G显带核型分析是检测SA染色体异常的常规方法，但存在培养易失败、结果不稳定、分裂相少、染色体形态欠佳等问题。近年发展起来的二代测序（next generation sequencing，NGS）技术通过对样本进行全基因组扫描，可检出染色体小片段的重复、缺失及基因组缺陷。但该技术应用于早期自然流产绒毛组织的遗传学诊断尚鲜见报道。为探讨流产组织染色体检测的最佳方法，本研究应用NGS技术对SA患者的流产绒毛组织进行全基因组测序，并与G显带核型分析对照，旨在寻找SA的遗传学病因，探讨NGS技术在流产组织检测中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象2013年5月—2014年12月在我院生殖中心就诊的不明原因的早期SA患者87例，年龄23～42岁，平均（32.4±4.7）岁，孕8～12周，B超诊断为胚胎停育，其中偶发性流产55例，复发性流产32例。患者根据年龄分为2组，年龄≥35岁组35例，＜35岁组52例。

1.2 方法

1.2.1 G显带核型分析绒毛染色体采用改良绒毛染色体直接法按文献［3］中的步骤操作，取流产清宫的典型绒毛组织10 mg左右，立即在1640培养基中漂洗干净，剪碎、低渗、固定，常规染色体制片，G显带。利用计算机染色体分析系统进行核型分析。每份标本至少计数20个分裂相，分析5个核型。

1.2.2 NGS技术检测流产绒毛组织取流产的胎儿绒毛组织100 mg，用PBS或生理盐水清洗3～5次，通过Qiagen QIAamp DNA Mini试剂盒提取全基因组DNA，应用Qbuit、凝胶电泳技术对DNA质量进行检测，确保DNA浓度不低于30 μg/L。将样品DNA打碎至250 bp大小的片段。末端修复：3′端加碱基A，使DNA片段能与3′端带有T碱基的特殊接头连接，用磁珠法选择需回收的目的片段产物。使用PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段（10个循坏）。构建好的文库经Agilent 2100 Bioanalyzer及实时荧光定量PCR检测合格后，将一定量的文库按照等物质的量混合，上机测序。基于拷贝数变异的检测方法，用SOAP比对软件，将每个读长的测序碱基与人类基因组参考序列（hg19）进行比对，通过唯一比对的读长数据进行染色体异常分析。

1.3 统计学方法使用SPSS 17.0统计软件进行分析，计数资料的组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NGS与G显带核型分析检测结果比较绒毛膜染色体G显带核型分析87例，检测成功65例，余22例镜下未见染色体核型，检测失败。NGS技术检测流产绒毛组织的成功率和异常检出率均高于G显带核型（P＜0.05），见表1。

Tab.1Comparison of the positive detection rate and the abnormality detection rate of the two methods表1 2种方法检测成功率与异常检出率比较例（%）

2.2 NGS与G显带核型分析异常结果比较见表2。NGS检测的51例异常中染色体数目异常48例，占94.12%，其中三体39例，双重三体2例，三重三体1例，单体6例。染色体结构异常3例，占5.88%。G显带核型分析检出的33例异常中染色体数目异常32例，占96.97%，其中三体24例，双重三体2例，三重三体1例，单体5例。染色体结构异常1例，占3.03%。

Tab.2Comparison of the results of NGS and G-banding chromosome karyotypes表2 NGS与G显带核型分析异常结果比较（例）

2.3 NGS与G显带核型分析相符情况分析NGS与G显带核型分析测序结果相符64例，不符1例。该例G显带核型分析结果正常，NGS结果为15号染色体的长臂部分存在片段缺失，seq del（15）（q25.3q26.3）（88，336，448–102，447，173），长约14.11 Mb；8号染色体的短臂部分存在片段重复，seq dup（8）（p23.3p12）（10，132–31，651，181），长约31.64 Mb，见图1。取夫妻外周血做G显带核型分析，示女方染色体平衡易位，46，XX，t（8；15）（p12；q25），见图2。

Fig.1The result of NGS detection图1 NGS技术检测结果图

Fig.2G-banding chromosome karyotype analysis图2 G显带核型分析图

2.4 不同组别的流产组织染色体异常率比较偶发性流产与复发性流产组织染色体异常率差异无统计学意义；≥35岁组的染色体异常率高于＜35岁组（P＜0.05），见表3。

Tab.3Comparison of the chromosomes abnormality in different groups表3 不同组别的流产组织染色体异常率比较例（%）

3 讨论

3.1 染色体异常是早期SA的主要原因SA大多是遗传因素导致，染色体异常的胚胎多数以流产结束。评估SA的病因和复发性流产的风险十分必要，NGS技术可对流产组织检测23条染色体非整倍体及5 Mb以上片段的缺失及重复情况。本结果NGS检出51例异常，异常率58.62%，与以往报道的异常率55%～66%［4］和5l%［5］基本相符。染色体数目异常48例，占异常的94.12%；其中三体39例，表明三体型异常为染色体非整倍性异常的主要类型，集中在13、14、15、16、18、21、22号染色体。5例X单体也是早期流产常见的染色体核型。与Stephenson等［6］报道的近90%染色体异常集中在三体异常基本相符。双重三体较少见，约占流产胚胎所有核型的0.21%～2.8%［7］。笔者发现2例双重三体及1例三重三体，涉及11、18、20、21、22号。染色体数目异常的发生主要源自双亲之一的配子形成时或妊娠初期受精卵卵裂时出现染色体不分离，则导致该染色体增多或减少1条，导致三体或单体［8］。由于染色体数目异常，阻碍了胚胎的正常发育，大多数遭遇自然淘汰而流产，虽然少数染色体异常患儿可以足月分娩，但常常智力障碍。因此，妊娠物绒毛染色体检测十分必要，尤其是对于早期SA患者，其有助于明确病因，避免不必要的检查和治疗，对再次妊娠提供生育指导。

3.2 流产组织染色体异常与流产次数无关本研究结果显示复发性流产和偶发性流产患者的染色体异常率分别是56.25%和60.00%，差异无统计学意义。Grande等［9］报道了96例复发性流产者的绒毛染色体异常率为60%，154例偶发性流产者的异常率为68%，差异也无统计学意义，与本研究结果基本一致，提示流产组织核型异常的风险与流产次数无关。

3.3 高龄孕妇非整倍体妊娠的风险较高本研究结果显示年龄≥35岁组的染色体异常率高于＜35岁组，表明随着女方年龄增大发生胚胎染色体异常导致流产的风险随之增大。Li等［10］用单核苷酸多态性微阵列技术对SA流产组织进行核型分析，发现年龄≥35岁组的非整倍体率（87.5%）明显高于＜35岁组（61.4%），与本研究结果一致。随着年龄的增长，卵细胞存在衰老退化的现象，受精卵细胞内纺锤丝老化，导致功能不全或丧失，生殖细胞或受精卵在细胞减数分裂或有丝分裂时发生染色体不分离，导致染色体数目或结构异常胎儿的发生［11］。因此高龄是引起胚胎染色体异常的高危因素。

3.4 NGS技术在早期SA遗传学诊断中的优势有研究报道G显带核型分析的成功率只有66%［12］，本研究为74.71%，比文献报道稍高。而NGS用于流产物遗传学检查的成功率为100%。G显带核型分析与NGS结果相符率达98.5%（64/65），不相符1例，笔者推断夫妻双方或一方可能为染色体异常携带者，进一步取其外周血进行G显带核型分析，发现女方为染色体平衡易位携带者，证实该流产儿染色体异常遗传自母亲，与NGS结果相符。

综上，NGS技术的诊断成功率及染色体异常检出率均较高，在早期SA妊娠物核型分析中具有显著优越性，可作为遗传学检测的一种补充技术，也可为流产夫妇进行遗传学病因分析，从而为再次妊娠提供指导，有较高的临床应用价值。

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（2015-01-16收稿2015-03-20修回）

（本文编辑闫娟）

Detection of chromosome abnormality by next-generation sequencing technology of miscarried embryo in the first-trimester

LIU Li，XU Fengqin，DI Jianyong，LIU Qinghua，LI Yi△
Department of Reproductive Medicine，First Center Hospital，Tianjin 300192，China△

ObjectiveTo investigate the clinical values of next-generation sequencing（NGS）technology in diagnosis of miscarried chorionic villi genetic disorders.MethodsPatients who underwent miscarriage（n=87）were enrolled in this study.Among all patients，32 cases were of recurrent miscarrage and 55 cases were of sporadic miscarriage.In all collected patients，35 women were 35 years or older while other 52 women were less than 35 years old.Positive detection rate and the abnormal detection rate were compared between these two methods.Chromosomes abnormal rates were also compared among different types of miscarrage and different ages.All aborted villi tissue were analyzed by NGS of whole genome and G-band⁃ing karyotype.ResultsThe successful detection rate of chorionic villi by NGS（100.00%）was higher than that of G-band⁃ing karyotype（74.71%），and the detection rate of abnormal chorionic villi by NGS（58.62%）was also higher than that of G-banding karyotype（50.77%）.Three cases of chromosome structure anomaly were found in those 51 chromosome anomalies（5.88%）.Other 48 cases of chromosome anomalies were aneuploidy anomalies（94.12%）include 39 cases of trisomy，2 cases of double trisomy and 1 case of triple trisomy and 6 cases of monomer.On the other hand，32 cases of chromosome aneuploi⁃dy anomalies were found in 33 chromosome anomalies by G-banding karyotype，which include 24 cases of trisomy，2 cases of double trisomy，1 case of triple trisomy，5 cases of monomer and 1 case of chromosome structure anomaly.Most NGS re⁃sults（n=64）were in agreement with G-banding karyotype but with 1 case of discrepancy.Chromosomal abnormality rate de⁃tected by NGS in sporadic miscarrage group and recurrent spontaneous miscarrage group were 60.00%and 56.25%respective⁃ly.There was no significant difference（P＞0.05）.Chromosomal abnormality rate picked by NGS in women aged≥35 years old（71.43%）was higher than that in women＜35 years old（50.00%）with statistically significant difference（P＜0.05）.ConclusionNGS technology showed highly accuracy in detecting chromosomal abnomality from villi tissue.Therefore，it could help to detect genetic disorders of miscarrage.It is useful to determine the reasons of miscarrage and guide the next pregnancy.

next generation sequencing；chromosome aberrations；abortion，spontaneous；chorionic villi；G-banding karyotype；genetics

R715.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.028

天津市第一中心医院生殖医学科（邮编300192）

刘丽（1966），女，主任技师，硕士，主要从事医学遗传及生殖医学研究

△通讯作者E-mail：liyi6656@163.com