Wnt3a在慢性牙周炎中的表达及临床意义

程焕芝，高秀秋

Wnt3a在慢性牙周炎中的表达及临床意义

程焕芝，高秀秋△

目的探讨Wnt3a在慢性牙周炎患者牙龈组织中的表达及其与附着丧失的关系。方法选择15例慢性牙周炎患者（牙周炎组）和15例牙周健康者（对照组），临床检查记录2组的探诊深度和附着丧失水平，采用RT-PCR和Western-Blot检测牙龈组织中Wnt3a的表达水平，并分析Wnt3a蛋白表达与附着丧失的相关性。结果牙周炎组的探诊深度高于对照组（mm：7.93±1.56 vs 1.83±0.37），其临床附着丧失为（7.76±1.34）mm，而对照组的口腔检查中未见临床附着。与对照组比较，牙周炎组的牙龈组织中Wnt3a mRNA（0.49±0.03 vs 0.36±0.04）和蛋白的表达水平（0.57±0.14 vs 0.43±0.17）均较低（t分别为12.015和2.381，P＜0.05）。并且，附着丧失的程度与牙周炎患者牙龈组织中Wnt3a蛋白的表达呈负相关（r=-0.564，P=0.028）。结论Wnt3a在慢性牙周炎中表达下调，与慢性牙周炎的附着丧失有密切关系，可能在慢性牙周炎的骨吸收中起到了一定的作用。

牙周炎；慢性病；牙龈；Wnt蛋白质类；Wnt3a；临床附着丧失

牙周炎是以牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）破坏为主要特征的感染性疾病，以牙周袋的形成、进行性的附着丧失和牙槽骨吸收为临床表现。除牙周感染的微生物直接引起牙周组织破坏外，宿主对于感染的应答是引起牙周组织损害的主要原因。牙槽骨吸收是牙周炎最具特征性的表现，是免疫炎症反应与骨相关细胞相互作用的结果。核因子-κB/核因子受体激活剂/核因子受体活化因子配体（NF-κB/RANK/RANKL）与破骨细胞的分化和成熟有关，是调节许多骨代谢紊乱病（骨吸收、风湿性关节炎、骨癌、牙周炎）中骨丧失的关键因子［1］。Wnt信号的激活可以导致骨量增加，Wnt信号的抑制导致骨量减少。有关Wnt信号通路的抑制剂硬骨素（SOST）和Dickkopf相关蛋白1（DKK1）的研究［2］发现：抑制SOST可以增加骨密度，骨重建；DKK1的失活可以刺激骨重建，促进骨折愈合。但是关于Wnt信号通路与慢性牙周炎的相关性研究很少。本研究通过对慢性牙周炎牙龈组织中经典Wnt通路相关蛋白Wnt3a表达的分析，为慢性牙周炎骨丧失病理机制的研究提供新的视角。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2012年9月—2013年12月在辽宁医学院附属二院牙周病门诊就诊的15例慢性牙周炎患者（牙周炎组）和15例牙周健康对照者（对照组）。所有入选对象满足入选和排除标准。入选者已知研究目的，参加本研究潜在的危险和利益，并签署知情同意书。纳入标准：年龄35～60岁，至少有15颗牙（包括第三磨牙）。牙周炎患者依据1999年慢性牙周炎诊断标准确诊，30%以上区域都有探诊深度异常，临床附着丧失大于4 mm，至少有一颗牙因为牙周炎较重而需拔除（临床附着丧失大于7 mm并伴有探诊出血）；对照组没有临床附着丧失，探针出血区域小于30%，仅因需要进行牙龈成形术恢复牙龈形态或对称性进行手术。所有入选人员糖化血红蛋白低于6.5%，空腹血糖3.89～6.10 mmol/L，C反应蛋白阴性。排除标准：妊娠、哺乳期、吸烟或有5年以上吸烟史者，6个月内进行过牙周治疗或使用过抗生素者，2个月内使用过正畸托槽或口腔局部抗菌剂者。有与牙周炎相关或与Wnt信号通路拮抗剂有关的其他系统疾病如免疫疾病、糖尿病、骨相关疾病及其他并发症（骨质疏松、强直性脊柱炎、近期骨折、风湿性关节炎）者，长期抗炎治疗（糖皮质激素），应用免疫抑制剂，激素替代疗法，骨吸收抑制剂等，进行正畸治疗或牙髓根尖周治疗者。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂Trizol（Invitrogen，美国）；逆转录试剂盒（Taka⁃ra）；Wnt3a、18srRNA引物合成、PCR mix（大连宝生物）；兔抗人Wnt3a、β-actin蛋白抗体（Abcam Biochemicals）；PVDF膜（邦定公司）；ECL显色剂（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2.2 临床检查应用牙周探针探诊入选牙的6个位点（取6个位点的平均值，为改牙的临床指标），记录探诊深度和附着丧失水平（釉牙骨质界到龈沟底的距离）。对临床检查的数据和分区（探诊出血）的检查结果进行一致性检验，kappa值大于0.85。检测具有可重复性。

1.2.3 获取牙龈标本牙周炎患者牙龈标本在临床检测后1周进行获取。取自有拔牙指征的重度牙周炎患牙（探诊深度大于7 mm并伴有探诊出血），以期获得具有代表性的牙龈组织。如患者有1个以上的牙齿有拔牙指征，则选择牙周附着丧失最重的牙龈组织。牙周健康者为探诊深度（PD）＜3 mm，因为美学要求切除牙龈。获得的牙龈组织包括结合上皮、龈沟上皮和牙龈结缔组织。切取的牙龈分为2部分，一部分在-80℃冰箱中储存，用于RNA的提取，另一部分存放在含蛋白酶抑制剂的缓冲液中，用于Western-Blot实验。

1.2.4 RT-PCR检测Wnt3a mRNA的表达每3个实验对象的组织等比例混合，利用Trizol法提取牙龈组织中的mRNA，提取的mRNA溶解在DEPC水中，-80℃保存。利用紫外分光光度计测定mRNA的浓度。反转录试剂盒进行反转录（Turbo DNA-frees，Ambion Inc.，Austin，TX，USA），得到cDNA。PCR扩增反应体系20 μL，其中双蒸水（dd水）7 μL，PCR mix 10 μL，引物2 μL（应用Primer 6.0进行引物设计，见表1），cDNA模板1 μL。PCR反应条件94℃5 min，72℃10 min。循环条件：94℃30 s，变性温度55℃30 s，72℃30 s，40次循环。取PCR产物8 μL，经2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统仪内扫描，使用QuantityOne软件分析结果，以18s rRNA的灰度值进行标准校正，计算Wnt3a产物的相对量。

Tab.1The primer sequences and amplified fragments length of Wnt3a and internal control表1 PCR引物序列及扩增片段大小

1.2.5 Western-Blot检测Wnt3a蛋白的表达每3个实验对象的组织等比例混合作为一个实验单位，制备蛋白样品放于-80℃保存；利用Bradford试剂盒测定总蛋白含量；把样品调成相同浓度，加入上样缓冲液，沸水煮5 min；SDS-PAGE电泳：每例标本20 μL上样（100 V、40 mA）电泳；转膜：半干式电转印，硝酸纤维膜在转印液中平衡10 min，恒电压50 V转移2 h，TBST洗3次/5 min；封闭：用封闭液室温振摇封闭1 h；4℃孵育一抗过夜；37℃孵育二抗1～2 h；化学发光，显影，定影，凝胶图像分析。

1.3 统计学方法统计数据以SPSS 17.0软件进行分析，数据符合正态分布，以均值±标准差表示，2组间比较采用t检验。采用Pearson相关分析牙周袋深度与Wnt3a的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床检查结果牙周炎组的探诊深度（mm：7.93±1.56）高于对照组（mm：1.83±0.37），差异有统计学意义（t=14.482，P＜0.05）；其临床附着丧失为（7.76±1.34）mm，正常对照组患者的口腔检查中未见临床附着丧失。

2.2 慢性牙周炎牙龈组织中Wnt3a mRNA的表达水平与对照组（0.49±0.03）相比，牙周炎组Wnt3a的mRNA表达（0.36±0.04）显著下调，差异有统计学意义（t=12.015，P＜0.01），见图1。

Fig.1Transcription level of Wnt3a mRNA in chronic periodontitis and control group图1 慢性牙周炎患者与对照组Wnt3a mRNA的表达

2.3 慢性牙周炎牙龈组织中Wnt3a蛋白的表达水平对照组Wnt3a/β-actin的比值是0.57±0.14，牙周炎组是0.43±0.17，差异有统计学意义（t=2.381，P＜0.05），见图2。

Fig.2Expression of Wnt3a in chronic periodontitis and control group图2 慢性牙周炎患者与对照组Wnt3a的表达

2.4 临床附着丧失与Wnt3a蛋白表达水平的相关性结果显示，临床附着丧失的程度与牙周炎患者牙龈组织中Wnt3a蛋白的表达呈负相关（r=-0.564，P=0.028）。

3 讨论

牙周炎是一类以牙龈炎症和牙槽骨吸收为主要特征的慢性炎症性疾病，可造成牙周支持组织的进行性破坏，最终导致牙齿丧失。在我国慢性牙周炎导致的牙齿丧失已经成为中老年人牙齿丧失最主要的原因，第三次全国口腔健康调查数据显示，我国45岁以上人群中80%以上存在不同程度的牙周问题。牙槽骨的吸收是牙周炎的一个主要特征。Wnt信号通路是参与骨形成和骨破坏的一个重要的信号通路，在骨质疏松、风湿性关节炎、骨癌、强直性脊柱炎、多发性骨髓瘤等疾病中发挥了重要作用［3］。但是关于Wnt信号通路与慢性牙周炎相关性的研究却很少。Napimoga等［4］在有关人慢性牙周炎与SOST、DKK1相关性的研究中观察到了慢性牙周炎中Wnt信号通路抑制剂SOST和DKK1表达的上调。

本研究发现慢性牙周炎患者牙龈组织中Wnt3a配体的表达低于牙周健康者，并且牙龈组织中Wnt3a的表达量与临床附着丧失的水平呈负相关。Zhong等［5］研究发现，在人类和小鼠中均可观察到Wnt途径的增强可最终导致成骨增加。相关研究发现，Wnt3a能抑制破骨细胞的分化成熟，抑制骨吸收，同时Wnt3a还有明显的抗炎作用［6-7］。

慢性牙周炎中Wnt3a表达减弱，Wnt信号通路的抑制剂表达增强［3］，Wnt信号通路的增强可以增加骨量，同时体外细胞实验观察到：经典的Wnt信号通路可以通过NF-κB调节破骨细胞的成熟，抑制骨吸收［8］。多数情况下，Wnt配体可以促进骨形成［9］，在胫骨可以促进骨整合。最近的一项研究证实Wnt3a通过诱导BMP9的表达促进碱性磷酸酶活性，同时Wnt3a还可以上调骨钙素（OC）和骨桥蛋白（OPN）的表达［10］。这与研究中观察到的Wnt3a的表达水平与附着丧失水平呈负相关一致。Wnt信号通路中的Wnt配体可以作为骨形成的刺激因子促进骨结合的形成，提高种植的成功率［11］。

慢性牙周炎中炎症引起的牙槽骨吸收与Wnt3a的表达有一定的相关性，这为研究牙周炎引起的骨吸收提供了一个新的研究思路。从机体内信号通路的方向进行研究，可能为阐明包括牙周炎在内的一些骨破坏性疾病的病理机制提供一定的理论基础，为预防和治疗牙周炎提供新的靶点。

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（2014-09-18收稿2015-03-05修回）

（本文编辑魏杰）

Expression of Wnt3a in chronic periodontitis and its clinical significance

CHENG Huanzhi，GAO Xiuqiu△
The Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China△

ObjectiveTo study the expression of Wnt3a in chronic periodontitis patients and its clinical significance. MethodsWnt3a expression was examined by RT-PCR and Western-Blot in 15 cases of chronic periodontitis gingival tis⁃sues and 15 normal tissues.Probe depth and attachment loss were also compared between these two groups.Correlation be⁃tween Wnt3a expression and attachment lose were also analyzed.ResultsProbe depth was deeper in chronic periodonititis groups than that in control group（mm：7.93±1.56 vs 1.83±0.37）.Attachment loss was（7.76±1.34）mm in chronic periodonti⁃tis group while it was not seen in control gorup.Wnt3a was lower both in transcription level（0.49±0.03 vs 0.36±0.04）and expression level（0.57±0.14 vs 0.43±0.17，P＜0.05）in chronic periodonitis tissue compared with that in normal tissues.The higher clinical attachment loss was negatively correlated with expression of Wnt3a（r=-0.564，P=0.028）.Conclusion Wnt3a is expressed less in chronic periodontitis than that in control group.Wnt3a plays an important role in attachment loss and bone absorption.

periodontitis；chronic disease；gingiva；Wnt proteins；Wnt3a；clinical attachment loss

R781

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.014

辽宁省自然科学基金项目（2013022024）

锦州，辽宁医学院附属第二医院（邮编121000）

程焕芝（1990），女，硕士研究生，主要从事牙周病的预防和治疗方面研究

△通讯作者E-mail：jzgaoxiuqiu1988@163.com