DNA条形码技术在口岸媒介生物种类鉴定中的应用

张 勤 刘亚风 王晓梦 张 芳 王 凯 高 洁

(河南出入境检验检疫局， 郑州 450003)

随着国际贸易往来的增加，媒介生物及其携带的病原体随交通工具、货物、行李等物件传入我国的风险也随之增加，对其进行准确的鉴定和病原体监测是疫病预防和控制的核心步骤。然而目前对媒介生物种类物种鉴定仍以形态学鉴定为主，但以传统的形态学鉴定存在样本发育状态、肢体完整性、专家依赖性等局限性，此外由于媒介生物种类繁多、近似种难以区分以及数据共享性差等因素，在实际工作中常常难以快速鉴别。自Hebert等(2003)在前人工作基础上提出以线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(COⅠ)为标准基因的DNA条形码技术，随后有关DNA条形码 (DNA Barcoding) 的研究在世界各地开展，目前已成功应用于多个生物类群中。COⅠ基因比其他线粒体基因拥有更多的系统发育信号，其密码子的第3位核苷酸表现出很高的碱基置换率，这使得COⅠ基因在分子进化速率方面超出12S rDNA和16S rDNA两倍之多(Pereiraetal., 2010)。近年来，随着分子生物学技术的发展，分子鉴定以其特有的优势成为形态学鉴定的有力补充。

本研究应用DNA 条形码技术对河南口岸入境截获和本底调查中难以通过形态学鉴定的媒介生物进行了DNA条形码扩增和序列比对，解决了在实际工作中的难题，充分显示了DNA条形码技术对传统形态学鉴定补充作用。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的样本为郑州东站口岸截获的1只形态不完整的蚊(孟加拉)和5只蜱(澳大利亚)、郑州机场口岸本底调查中2只形态残缺的蝇。DNA提取试剂盒购自Qiagen公司；PCR试剂盒、Premix TaqTM酶、DNA Marker、琼脂糖和Gold View核酸染料、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和pMD18-T载体均购自TaKaRa公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1引物：COⅠ基因扩增通用引物LCO1490：5′- G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T GG -3′和HCO2198：5′- T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T CA -3′(Flomeretal., 1994)由Invitrogen公司合成。

1.2.2目的基因的扩增: 分别取蜱、蚊、蝇样本的一侧后足，按照Qiagen DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，-20℃保存备用。按照PCR试剂说明书中推荐的引物、dNTP浓度作为初始扩增条件，PCR反应体系(25 μL): DNA模板2 μL，10 μmol/L LCO1490和HCO2198各1 μL，Premix TaqTM12.5 μL，ddH2O 8.9 μL，总体系25 μL，混匀后进行PCR反应。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃1 min，30个循环；72℃10 min；1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后进行测序。

1.2.3序列分析：将截获样本的序列在BOLD Systems v3中进行比对，根据比对结果选取参考序列，使用MEGA 4.1软件进行系统发育分析。

2 结果

2.1 COⅠ基因的扩增

8份样本经PCR扩增后凝胶电泳检测，截获的5只蜱、1只蚊以及本底的2只蝇均扩增出700 bp左右的片段(图1)，将扩增产物送Invitrogen公司进行序列测定。

图1 DNA条形码扩增结果Fig.1 CO I fragments of the 8 medical vectorsM:100 bp DNA 分子量标准；1-5：5份蜱样本CO I基因扩增产物；6：蚊样本CO I基因扩增产物；7～8：2份蝇样本CO I基因扩增产物。M:100 bp DNA ladder；1- 5： 5 tick samples; 6：One mosquito sample；7-8： 2 local fly samples.

2.2 序列分析

2.2.1蜱样本序列分析: 将5只蜱样本的CO I序列在BOLD Systems v3中进行比对，结果显示5只样本与BOLD Systems v3中微小牛蜱序列同源性为99.55%～99.7%，在GenBank中选取同源性较近的微小扇头蜱Rhipicephalusmicroplus、囊形扇头蜱R.bursa、短小扇头蜱R.pumilio、俄扇头蜱R.rossicus、血红扇头蜱R.sanguineus、镰形扇头蜱R.haemaphysaloides、图兰扇头蜱R.turanicus共计16条参考序列(表1)，对样本(T1,T2,T3,T4,T5)以及16条参考序列COⅠ片段以Kimura 2 -parameter模式构建邻接法系统发育树(图2)，结果显示样本均与微小牛蜱聚在一个分支，表明5只蜱样本均为微小扇头蜱。经形态学检查，其中3只为雄性，1只为雌性，1只为幼蜱。

表1 蜱参考序列信息Tab. 1 Information of COⅠ sequences of reference tick species

2.2.2蚊样本序列分析: 蚊样本COⅠ 序列与BOLD Systems v3中致倦库蚊的同源性高达100%。在GenBank中选取尖音库蚊复合组、按蚊亚科11条序列以Kimura 2 -parameter模式构建邻接法系统发育树(图3)，结果显示尖音库蚊复合组成员聚在一个分支，样本与致倦库蚊又独立聚在一个小分支中，表明本次截获蚊样本应为致倦库蚊。

2.2.3蝇样本序列分析: 2份蝇样本中的1号蝇样本在GenBank中与紫绿蝇Luciliaporphyrina同源性为100%，在BOLD Systems v3与紫绿蝇同源性为99.69%。邻接法系统发育树结果显示蝇

图2 基于蜱CO I片段构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic analysis of the tick specimens based on CO I sequences

表2 蚊参考序列信息Tab. 2 Information of COⅠ sequences of reference mosquito species

样1与紫绿蝇聚在同一小分支中(图4)。2号蝇样本在BOLD Systems v3和GenBank中比对后，结果显示与铜腹重毫蝇Dichaetomyiabibax(KP161685.1)同源性为100%，而与其他蝇种同源性低于94%，经形态特征比对后，确认该样本为铜腹重毫蝇。

表3 蝇参考序列信息Tab. 3 Information of fly COⅠ sequences

图3 基于蚊CO I片段构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic analysis of the mosquito species on the sequences of CO I

图4 基于蝇样本CO I片段构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic analysis of the fly specimens based on CO I sequences

3 讨论

大量研究结果证实COⅠ基因一段长为648 bp的区域可作为动物分类和鉴别的理想DNA条形码(王颖等，2013)。每个物种都有唯一的COⅠ序列，COⅠ序列的种内遗传差异通常小于1%，极少数高于2%，但种间差异最小为2%，最高可达11.3%(Hebertetal., 2003)。近几年来，基于COⅠ基因的DNA条形码技术已成功应用于鱼类、鸟类和昆虫等动物的分类鉴定，在我国国境口岸蚊类鉴定工作中，DNA条形码技术也成为形态学鉴定的有效补充(赵明等2008；赵峰等，2011；王刚等2012；魏晓雅等，2014；吴容泉等，2014；刘德星等，2015；常雪莲等，2015)。

蜱是陆地脊椎动物的专性、非永久性体外寄生虫，它们在吸食血液的同时还传播着病毒、立克次体、细菌、螺旋体等各种病原体(王启果等，2012)。微小扇头蜱属硬蜱科，扇头蜱属，主要分布于N30°与S48°之间的亚洲、美洲、非洲和大洋洲等地。在我国，微小扇头蜱分布广泛，寄生于虫、大型动物，牛、马、羊、猪、狗、猫、兔等家畜和野生动物，有时也袭击人。微小扇头蜱是森林脑炎病毒、贝氏立克次体(Q热)、原虫病、莱姆病旋体、牛巴贝斯虫等病原体的传播媒介(唐昊等，2015)。江莉等(2014)利用DNA条形码技术鉴定出国内首次截获的肩突硬蜱；古小彬等(2010)通过ITS-2、COⅠ和COⅡ对嗜群血蜱和长角血蜱进行了系统发育分析，证实它们是血蜱属中亲缘关系较近的两个种类。

蚊类隶属双翅目，长角亚目的蚊科，是国内外研究最为广泛和深入的昆虫类别。蚊类中存在许多形态相似的复合组，以及口岸截获的蚊类常常出现肢体残缺等原因，对此类样本难以进行准确的形态学鉴定。目前全世界已知的蚊种有40个属，3 500多个亚种。经由蚊类传播的疾病有疟疾、流行性乙型脑炎、黄热病等80多种，因此蚊类是国境口岸监测的重要医学媒介生物。致倦库蚊属于尖音库蚊复合组，该复合组还包括尖音库蚊指名亚种、淡色库蚊和骚扰库蚊。其中致倦库蚊和淡色库蚊是我国主要的家栖蚊种，更是丝虫病和乙型脑炎的重要传播媒介。该复合组的各亚种形态颇为相似，其雄蚊阳茎侧板中叶的形态特征是种下分类的重要依据，阳茎侧板一侧内叶和中叶的间距与阳径两中叶末端间距的比值(DV/D值)是该复合组的重要鉴别特征 (赵彤言等，1994)。

铜腹重毫蝇属棘蝇亚科，重毫蝇属，分布在我国吉林、辽宁、河北、山西、河南、广东、云南、西藏等地。成蝇常在森林的树叶、草地和粪便上停息，体长约6.5 mm，体呈黑褐色，触角第2节红棕色，胸大部分为黑色，小盾片背基部和中央呈褐色，小盾下有淡色纤毛；后背中鬃3，翅侧片具毛，腹侧片鬃1∶2；翅下大结节褐色；M1+2脉末端明显向前呈弧形弯曲；腹部呈黑褐色带青铜金属光泽(刘亚男，2012)。紫绿蝇属丽蝇科，绿蝇属,在我国广泛分布。体呈紫色或青紫色金属光泽；雄额狭，间额在最狭处消失，触角特别长；雌额亦狭，头宽为额宽的3.5倍，侧额和侧颜等宽。后中鬃2对，前缘基鳞黑色，亚前缘骨片棕色，有黑色小刚毛l；腋瓣淡棕色至棕色，上腋瓣外缘呈淡棕色腹部背板后缘带不明显，第3背板无中缘鬃(陆宝麟等，2003)。近年来DNA条形码技术在口岸蝇类鉴定中应用广泛。赵峰等(2011)应用DNA条形码技术对常见的4科10属14种卫生蝇类进了鉴定，结果表明DNA条形码鉴定与形态学鉴定结果相一致；吴荣泉等(2014)通过对福建省蝇类DNA条形码的分析，证实COⅠ基因可用于丽蝇科中的各种的鉴定，但铜绿蝇和丝光绿蝇在进化树上不能完全分开；刘德星等(2015)应用DNA条形码技术鉴定出国内未见分布的澳洲麻蝇。

本研究再次说明，将DNA条形码鉴定和形态学鉴定结合的"综合分类法(Integrated taxonomy)"能够有效提高鉴定的效率和准确性。