家蝇幼虫抗菌肽粗提物对原代FBL-3细胞增殖周期的影响*

聂守民 邢佳欣 赵瑞君** 程璟侠 刘娟娟

(1.山西医科大学基础医学院，寄生虫教研室，太原 030001；2.山西省疾病预防控制中心病媒生物防控科，太原 030001)

家蝇幼虫抗菌肽能有效杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒害作用的优势是当前研究的一大热点。随着对家蝇幼虫抗菌肽抗肿瘤细胞谱的认识，它的作用机制越来越受到人们的关注。目前报道的作用机制主要有细胞膜机制、线粒体机制、细胞骨架机制和细胞周期机制(包永芬等，2011)。

FBL-3细胞为红白血病细胞，在体外条件下经多次传代培养之后，细胞特性会发生明显改变，细胞毒力降低，对实验数据的准确性造成了干扰(吴远彬等，2010)。所以需要通过构建小鼠模型来获取更接近体内生物学特性的原代FBL-3细胞进行实验，大大提高了实验结果的可应用性。我们前期研究发现家蝇幼虫抗菌肽粗提物对红白细胞病FBL-3肿瘤细胞具有抑制作用，但未对其作用机制进行研究，本文模拟体内生物学特性，现以原代FBL-3肿瘤细胞为对象，探究家蝇幼虫抗菌肽粗提物对其细胞增殖周期的影响，为家蝇幼虫抗菌肽的功能研究和临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株：FBL-3细胞，本实验室常规传代培养，-80℃冰箱保存。

1.1.2三龄家蝇幼虫：在山西省疾病预防控制中心虫媒科的养蝇室内进行饲养，为多代培养的纯种品系。饲养条件：室温20～30℃，相对湿度控制在55%左右。

1.1.3C57BL/6小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.4主要试剂：RPMI-1640培养基(北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司)、胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride、 PMSF)(美国Sigma公司)、生理盐水(高压灭菌)(华仁药业股份有限公司)、甲醇(天津市大茂化学试剂厂)、乙腈(acetonitrile, ACN)分析纯(天津科密欧化学试剂有限公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、青链霉素混合液(10 000U/mL青霉素和1 000μg/mL链霉素)、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)(美国Sigma公司)。

1.1.5主要设备：无菌操作台(苏州安泰空气技术有限公司)、CO2培养箱311(美国Thermo Forma公司)、奥林巴斯IX83倒置显微镜(奥林巴斯中国有限公司)、低速离心机LDS-ZA(北京医用离心机厂)、纯水仪(重庆摩尔水处理设备有限公司)、真空冷冻干燥机FD-1-50(北京博医康实验仪器有限公司)、高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、 Sep-Pak C18柱(美国Waters公司)、核酸蛋白测定仪(德国艾本德公司)、Count star自动细胞计数仪，高速低温台式离心机TGL-16G(上海恒勤仪器设备有限公司)、流式细胞仪(B.D Corp,USA)。

1.2 方法

1.2.1家蝇幼虫抗菌肽粗提物的诱导：用2号昆虫针蘸E．coliDH5a(大肠杆菌)菌液针刺三龄家蝇幼虫腹后体壁，一次一虫，诱导后置于新鲜麸料内继续饲养24 h(党向利等，2011)。研钵预冷30 min，之后将诱导好的三龄家蝇幼虫置于研钵内，加入研磨液(含有1 mmol/L PMSF的无菌生理盐水)，每1 g幼虫加入1 mL研磨液，迅速、充分研磨。研磨完毕以4 ℃、12 000 r/min 离心30 min(低温离心机应先空转，温度维持在4℃)，离心重复2次，取上清液。

1.2.2固相萃取：活化：用5 mL甲醇作为强溶剂润湿固定相，然后用5 mL高压三蒸水作为弱溶剂加以平衡。上样：上样前将上清液再低温离心1次(4 ℃，12 000 r/min，30 min)，之后取5 mL上清液上柱，流速控制在1mL/min。淋洗：用三蒸水作为淋洗液洗柱，去除干扰杂质。洗脱：用三蒸水配制80 %浓度的乙腈水溶液，然后取5 mL 洗脱柱体，收集洗脱组分，-80 ℃冰箱保存24 h。最后真空冻干机干燥， 用PBS重溶，核酸蛋白仪检测浓度。

1.2.3小鼠模型的构建：实验用小鼠为无特定病原体级别，生长状况良好。挑选6周龄的C57BL/6雄性小鼠10只，体重(20±1)g。取对数生长期的FBL-3细胞，弃掉原培养液，用PBS洗2遍，1 mL胰蛋白酶消化2～3 min，加入同等量的完全培养基终止消化后进行离心(1 000 r/min，5 min)，用无血清的RPMI-1640重悬细胞，细胞计数并调整浓度为2×106个/mL。采用右腋皮下注射的方式接种6周龄的小鼠10只，每只 0.2 mL。每天观察并记录小鼠肿瘤生长情况。一周后可在小鼠腋下摸到明显的的肿块，肿块较硬且边缘整齐的小鼠为模型小鼠。

1.2.4原代FBL-3细胞的获取：挑选两只肿瘤长势最好的模型小鼠，颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精浸泡3 min。超净工作台内无菌剥离小鼠肿瘤组织并剪碎，于100目网筛上充分研磨，研磨的同时滴加PBS冲洗。研磨后的组织液收集到15 mL离心管，1 000 r/min，离心5 min，弃上清。再加入5 mL红细胞裂解液，静置3 min，裂解的红细胞发生沉淀，小心吸取上清进行离心，用PBS洗涤3次，RPMI-1640培养液重悬，转移至细胞培养瓶，于倒置显微镜下观察，细胞分散均匀。CO2温箱内继续培养以获取FBL-3原代细胞。

1.2.5原代FBL-3细胞增殖周期变化的检测：取对数生长期的原代FBL-3细胞，弃掉原培养液，用PBS洗两遍，1 mL胰蛋白酶消化2～3 min，加入同等量的完全培养基终止消化后进行离心(1 000 r/min，5 min)，用细胞培养液重悬细胞，细胞计数并调整浓度为2×105个/mL，接种到35 mm细胞培养皿中。CO2温箱中继续培养24 h后，各培养皿弃掉原培养液，PBS洗两遍，对照皿中加入3 mL细胞培养液，实验组分别加入75、150、300 μg/mL的家蝇幼虫抗菌肽粗提物1和2 mL的细胞培养液，每个浓度各设置3个培养皿。CO2温箱中继续培养12、24、36 h之后消化收集各培养皿细胞，用PBS洗两遍，加入2 mL 4℃预冷的70%酒精固定细胞，-20℃保存。流式细胞仪检测前，每管细胞用PBS洗1次，加入500 μL结合液和5 μL PI，避光条件下放置30 min，振荡混匀后上机检测。

2 结果

2.1 模型小鼠肿瘤生长情况

本实验选取了10只6周龄的C57BL/6雄性小鼠，其中7只小鼠长出了肿瘤，造模成功率达到了70%。第1 d，小鼠腋下出现肿瘤结节；第2～5 d，小鼠肿瘤结节开始生长并形成肉眼可见的肿块；第6～8 d，肿块基本稳定，游标卡尺测量肿瘤团块的长径和短径，计算肿瘤的相对体积为6 cm3。经颈椎脱臼处死的小鼠，剥离其腋下肿块，质量为2.15 g。

2.2 原代FBL-3细胞的生长情况

模型小鼠的肿瘤组织经研磨、离心后转移至细胞培养瓶中，于倒置显微镜下观察，发现细胞分散均匀。37℃、5%CO2，饱和湿度培养6 h之后，倒置显微镜下观察发现细胞形态规则，呈圆形或椭圆形贴壁生长，细胞密度变大(图1)。

图1 培养6 h之后的原代FBL-3(×100)Fig. 1 The primary FBL-3 was cultured after 6 h(×100)

2.3 家蝇幼虫抗菌肽粗提物对原代FBL-3细胞增殖周期的影响

由表1和表2可以看出，原代FBL-3细胞经家蝇幼虫抗菌肽粗提物作用之后其细胞周期发生了变化：G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低。作用浓度一致的前提下，随着作用时间的延长作用效果增强(表1，图2)；表2数据说明，同时作用时间一致的前提下，随着作用浓度的提高作用效果增强(表2，图3)。综上表明，家蝇幼虫抗菌肽粗提物对原代FBL-3细胞的作用效果呈现剂量-时间依赖关系。实验结果与对照组相比差异具有统计学意义，P<0.05。

表1 300 ug/mL 家蝇幼虫抗菌肽粗提物作用后原代FBL-3细胞周期分布情况Tab.1 The cell proliferation cycle with flow cytometry analysis of FBL-3 cells treated by crude extracting of antibacterial peptides of M. domestica with concentration of 300 μg/mL

表2 不同浓度家蝇幼虫抗菌肽粗提物作用36 h后细胞周期的分布情况Tab.2 The cell proliferation cycle with flow cytometry analysis of FBL-3 cells treated by crude extracting of antibacterial peptides of M. domestica with different concentrations

3 讨论

白血病是一类造血干细胞异常的恶性疾病，分类很多，不管是哪一类型的白血病目前治疗方式首选都是化疗。化疗这种方式在治疗白血病的同时也会给病人带来严重的副作用：抑制骨髓造血系统，使白细胞和血小板数目出现下降；不同程度的损害肝脏细胞；对呼吸系统、泌尿系统及心血管系统产生毒性作用等。随着家蝇幼虫抗菌肽研究的不断深入，发现其对多种白血病细胞株具有较强的抑制作用，但是作用机制尚没有定论，所以本课题组利用家蝇幼虫抗菌肽作用于原代FBL-3肿瘤细胞，对其作用机制进行了初步研究，具有一定的科研意义。

图2 300 μg/mL家蝇幼虫抗菌肽粗提物作用后原代FBL-3细胞周期分布图Fig. 2 The cell proliferation cycle with flow cytometry analysis of FBL-3 cells treated by crude extracting of antibacterial peptides of M. domestica with concentration of 300 μg/mL

图3 不同浓度家蝇幼虫抗菌肽粗提物作用36 h后细胞周期的分布图Fig. 3 The cell proliferation cycle with flow cytometry analysis of FBL-3 cells treated by crude extracting of antibacterial peptides of M. domestica with concentrations

家蝇幼虫抗菌肽是一类小分子多肽，具有分子量小、抗菌谱广、热稳定性好等优点(Lietal.，2012)，在先天免疫等方面扮演着重要的角色(张先文等，2007)，它还能够选择性的作用于肿瘤细胞而对正常细胞无毒副作用(Houetal.，2007)，其抗肿瘤作用已经被诸多试验所证实。赵瑞君等(2007)发现家蝇幼虫抗菌肽能够作用于人髓样白血病细胞株K562、人B淋巴细胞瘤细胞株Daudi、人食管癌细胞株Eca-109及人膀胱癌细胞株T24等人源性肿瘤细胞，且有效杀伤作用较强；万启惠等(2008)利用家蝇幼虫抗菌肽作用于人皮肤黑色素瘤细胞株A375和子宫内膜癌细胞株JEC，发现家蝇幼虫抗菌肽对这两种肿瘤细胞具有较好的抑制作用；魏洪等(2013)利用家蝇三龄幼虫血淋巴40%固相萃取组分作用于肉瘤细胞株S180，结果显示家蝇三龄幼虫血淋巴40%固相萃取组分对该肿瘤细胞具有较强的抑制作用，细胞增殖抑制率最高可达79%。这些都是家蝇幼虫抗菌肽抗癌的有力佐证，随着研究的不断深入，其抗癌谱日渐拓宽，作用机制也日益受到关注。

FBL-3细胞为小鼠红白血病细胞，可以经皮下、肌肉和静脉注射的方式在C57BL/6小鼠体内成瘤。但是，FBL-3细胞经多次传代培养之后，细胞毒力会发生明显的降低，细胞特性也会有所改变，给实验结果的可靠性带来影响。所以我们用常规传代培养的FBL-3肿瘤细胞经右腋皮下注射到C57BL/6小鼠体内，以此来构建小鼠模型获取原代肿瘤细胞，恢复FBL-3细胞的生物学特性。C57BL/6小鼠为常用的实验小鼠，其造血系统与人类的非常相似，而且近交系的小鼠具有遗传背景均一、较高的稳定性和构建模型的周期短等优点，所以实验选用C57BL/6小鼠来构建红白血病模型具有一定的优势。

细胞周期即细胞生长和分裂的周期，是指细胞在一次分裂结束后到下一次分裂结束所经历的过程。肿瘤细胞增殖周期分为4个时期：DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有丝分裂期(M期)，G1期之前存在一个相对静止期为G0期。传统化疗药物的作用靶点主要是细胞周期，通过阻滞细胞周期诱导细胞凋亡(黄炜炜等，2012)。本实验研究发现家蝇幼虫抗菌肽作用原代FBL-3细胞后，其细胞增殖周期发生了改变：G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低。表明，家蝇幼虫抗菌肽粗提物使原代FBL-3肿瘤细胞的细胞增殖周期阻滞于G0/G1期，从而抑制了S期DNA的合成，这种作用效果呈现剂量-时间依赖关系。金小宝(2013)等研究发现家蝇抗菌肽Cecropin能使人肝癌BEL-7402细胞周期发生改变：G0/G1与G2/M期细胞比例降低，S期细胞比例升高。虽然与本实验结果不尽相同，但都说明家蝇抗菌肽能够作用于肿瘤细胞的细胞周期，从而对肿瘤细胞产生抑制作用。家蝇幼虫抗菌肽的作用机制并不仅限于阻滞细胞周期，还存在其他机制，可能是几种不同作用机制协同发挥作用，将在以后的实验作进一步的研究。