新疆石榴皮多酚的提取及其对酪氨酸酶的抑制作用

付建红，郭丽艳

（1.新疆特殊环境物种保护与调控生物学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆师范大学 生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054）

新疆石榴皮多酚的提取及其对酪氨酸酶的抑制作用

付建红1，2，郭丽艳1，2

（1.新疆特殊环境物种保护与调控生物学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆师范大学 生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054）

优化新疆石榴皮多酚的提取工艺，并研究石榴皮提取物对酪氨酸酶的抑制作用。采用超声波辅助法提取石榴皮多酚，通过单因素试验和正交试验确定其最佳提取工艺条件：丙酮体积分数70%、超声波功率200 W、提取温度40℃、料液比1∶35g/mL、提取时间50min、提取2次，在此条件下石榴皮多酚得率为23.77mg/g。同时测定了石榴皮多酚提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制活性，石榴皮多酚提取物质量浓度在12mg/mL时，对酪氨酸酶活力的相对抑制率为44.05%。该研究为从石榴皮中提取天然酪氨酸酶抑制剂提供了实验依据。

石榴皮；多酚；酪氨酸酶；抑制作用

石榴（Punica granatum L.）为石榴科石榴属植物，是新疆主要水果之一，主要分布在南疆喀什、和田等地区。在石榴加工过程中会产生大量的石榴皮，若不加以综合利用，不仅造成资源浪费，而且还会对环境造成污染。石榴皮含有多酚、氨基酸、生物碱等多种生物活性成分［1-2］，其中多酚类物质在干石榴皮中的质量分数为10%～20%［3-4］。石榴皮多酚是石榴皮中多酚羟基化合物的总称，包括鞣花单宁、没食子单宁、鞣花酸、没食子酸、儿茶素、花色素、绿原酸和栎精等多种化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗菌、润肤美容、降血压和预防心脑血管疾病等多种生理和药理活性［4-7］。

酪氨酸酶普遍存在于人和动植物体内，是黑色素生物合成过程中的关键酶。随着酪氨酸酶的合成量和催化活力的升高，体内黑色素合成增多，导致皮肤色斑及黑色素瘤的形成。可通过抑制酪氨酸酶活力来预防和治疗色素沉着及黑色素瘤，因此，寻找有效且对人体无毒副作用的天然酪氨酸酶抑制剂，已成为药物和化妆品行业研究热点之一。石榴皮的主要成分多酚对·具有良好的清除作用，可用作酶的抑制剂［8］。Basiri等［9］研究了伊朗设拉子市石榴皮提取物对太平洋白虾酚氧化酶（酪氨酸酶）活性及冷藏期白虾质量的影响，结果表明石榴皮提取物对白虾酚氧化酶的抑制作用呈剂量依赖性方式。孙慧等［10］、谢贞建等［11］和张海均等［12］分别研究了石榴皮多酚提取物对醛糖还原酶、α-葡萄糖苷酶以及α-淀粉酶的抑制作用，探索了其降血糖作用的途径。但目前有关新疆石榴皮多酚提取物对蘑菇酪氨酸酶活性的影响尚未见报道。

笔者以新疆和田产“皮雅曼”石榴为原料，在单因素试验的基础上进行正交试验，筛选出石榴皮多酚的最佳提取工艺参数，同时探讨多酚提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用，以期为石榴皮资源的充分利用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

石榴皮粉由新鲜石榴皮晒干后粉碎、过830μm筛而成，置于干燥、避光的环境中保存备用。

没食子酸（AR），上海源叶生物科技有限公司；福林酚（BR），上海荔达生物科技有限公司；二甲亚砜（AR）、L-多巴（AR）、曲酸（AR）、蘑菇酪氨酸酶（BR），Sigma-Aldrich公司；乙醇、丙酮、甲醇、Na2CO3、NaH2PO4和Na2HPO4·12H2O均为市售国产分析纯。

UV-2800H型紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；RE-2000A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；WD-9412型恒温循环器，北京市六一仪器厂；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；GL-20GH型离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 石榴皮多酚的提取

准确称取5g石榴皮粉于磨口三角烧瓶中，按照一定比例加入一定体积分数的提取溶剂，搅拌均匀，置于超声波清洗器中，在超声波功率200 W、温度40℃的条件下超声处理一定时间，4 000r/min离心15min后取上清液，减压浓缩至原体积的1/10，获得多酚粗提液。利用没食子酸标准曲线的回归方程求出粗提液中多酚的含量，计算多酚得率。

1.3 石榴皮提取物中多酚含量的测定

(3)进一步修改完善配水、供水制度。在配水、供水过程中，将把“以需定供”转为“以供定需”，并在每个测水点上都修建标准断面，以提高测水、量水的标准性和透明度。真正使群众用明白水、交放心钱，达到科学用水，节约用水的止的。

1.3.1 没食子酸标准曲线的绘制

参照文献［4，6-7，9］作适当改进。精确称取没食子酸25mg，用蒸馏水溶解并定容至250mL，即得0.1mg/mL的标准品溶液。精密吸取标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL于10mL容量瓶中，加入1mL福林-酚显色剂，摇匀后再加入2mL质量分数为15%Na2CO3溶液，用水定容至10mL，室温下（避光）反应2 h后在760nm下测定吸光值。由吸光值对没食子酸浓度进行回归，得方程y=46.85x+ 0.075 5，相关系数R2=0.999 1。

1.3.2 多酚类物质含量的测定及得率的计算

移取多酚粗提液0.5mL置于10mL容量瓶中，依次加入1mL福林-酚显色剂及2mL 15%Na2CO3溶液并定容，按上述标准曲线测定方法测定吸光值。用回归方程计算多酚含量，按式（1）计算石榴皮多酚的得率。

式中：ρ为按标准曲线得出的提取溶液多酚的质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为石榴皮干粉质量，g。

1.4 单因素试验

称取一定量的石榴皮粉末，分别研究不同提取方法、提取溶剂、超声处理时间、超声处理温度、料液比和提取次数对多酚提取效果的影响。

1.5 正交试验设计

1.6 石榴皮多酚提取物对酪氨酸酶抑制作用的测定

以L-多巴为底物，参照文献［11-12］报道的方法进行酪氨酸酶的活性测定。先将提取物用含体积分数为5%二甲亚砜的磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定质量浓度的提取物溶液。按表1准确吸取提取物溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液和1.0mmol/L的L-多巴溶液，充分混合，于30℃下水浴10min后，加入酪氨酸酶溶液（150 U/mL），水浴反应15min，迅速转移至比色皿中，在475nm处测定各反应液吸光度值，按式（2）计算抑制率。阳性对照组以曲酸代替石榴皮提取液，空白组以含体积分数为5%二甲亚砜的pH 6.8磷酸盐缓冲液代替酶液和提取液。

式中：A1为酪氨酸酶催化氧化底物溶液产生的黑色素的吸光度值；A2为底物溶液的吸光度值；B1为酪氨酸酶活性受提取物抑制后溶液的吸光度值；B2为提取物的吸光度值。

表1 反应液组成Table 1 Composition of reaction liquidsmL

2 结果与讨论

2.1 石榴皮多酚提取的单因素试验

2.1.1 提取方法的选择

采用浸提法（时间1 h，温度60℃，料液比1∶20g/mL）、超声波辅助提取法（时间30min，温度40℃，料液比1∶20g/mL，功率200 W，频率40 kHz）和振荡提取法（振荡时间1.5 h，恒温摇床30℃，料液比1∶20g/mL，转速150r/min）进行试验，考察采用不同提取方法对石榴皮多酚得率的影响，结果见表2。由表2可知，超声波辅助提取的效果优于溶剂浸提法和振荡提取法。这是由于超声波使液体发生空化作用，物料周围空穴的形成、增大和闭合会产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎，增加有效成分的溶出速度，从而提高有效成分的浸提率和缩短浸提时间。

表2 不同提取方法对多酚得率的影响Table 2 Effects of different extraction methodsl on polyphenol yield

2.1.2 提取溶剂及其用量对石榴皮多酚提取的影响

称取石榴皮粉5g，料液比1∶20g/mL，超声波200 W，提取时间为30min，提取温度40℃，考察提取溶剂及其用量对多酚得率的影响，结果见图1。

图1 提取溶剂及其体积分数对多酚得率的影响Fig.1 Effects of different solvents and their volume fractions on yield of polyphenol

由图1可知：甲醇、乙醇和丙酮体积分数在30%～70%的多酚得率均高于各种纯溶剂提取时的多酚得率。有机溶剂和水的混合溶剂对多酚得率的影响效果从高到低依次为50%丙酮、70%丙酮、30%丙酮、30%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、70%甲醇、30%甲醇和50%甲醇。一方面是由于在植物体内多酚通常与蛋白质、多糖以氢键和疏水键形式形成稳定的化合物，而有机溶剂和水的复合体系具有氢键断裂的作用，因此复合体系有利于多酚的提取；另一方面可能由于丙酮等3种溶剂分子与水分子之间作用力不同造成溶剂对多酚溶解性能的不同所致。由于丙酮的多酚得率与乙醇、甲醇相比差异较大，因此，选用50%丙酮作为后续实验的提取溶剂。

2.1.3 提取时间对石榴皮多酚提取的影响

称取石榴皮粉5g，按料液比1∶20g/mL的比例加入体积分数为50%的丙酮溶液，在40℃、200 W的超声波条件下，考察提取时间（10、20、30和40min）对多酚得率的影响，结果见图2。由图2可知：随着提取时间的延长，多酚得率不断增高，30min时达到最大值。但随着提取时间进一步延长，多酚得率反而下降。这可能与多酚不稳定、易氧化受损有关。因此，确定提取时间为30min。

图2 提取时间对多酚得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on yield of polyphenol

2.1.4 提取温度对石榴皮多酚得率的影响

称取石榴皮粉2.5g，按料液比1∶20g/mL的比例加入体积分数为50%的丙酮溶液，在功率200 W的超声波条件下提取30min，考察温度对多酚得率的影响，结果见图3。由图3可知：提取温度对石榴皮多酚得率影响较显著。40℃时多酚得率最高，但超过40℃时，多酚得率反而下降。随着温度的升高，溶剂内分子运动速度加快，多酚的渗透、溶解、扩散速度也加快，使多酚得率得以提高。然而，多酚类物质的稳定性较差，长时间受热会发生氧化或水解反应，从而导致多酚得率下降。因此，确定提取温度为40℃。

图3 提取温度对多酚得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of polyphenol

2.1.5 料液比的选择

料液比是影响原料中多酚提取的重要因素之一。适当的料液比既可使原料中的多酚类物质得到充分提取，还可减少溶剂的消耗。称取石榴皮粉1g，在40℃的条件下用200 W的超声波提取30min，考察料液比对多酚得率的影响，结果见图4。由图4可知：多酚得率随溶剂用量的增大而增加。在料液比为1∶5～1∶20g/mL时，多酚得率增加的幅度较为明显；当料液比超过1∶20g/mL时，多酚得率的变化幅度较为平缓。这表明当料液比为1∶20g/mL时，原料中绝大多数多酚已被提取出来，再调整料液比，多酚得率也不会明显提高。考虑到节约成本，选用1∶20g/mL的料液比较适宜。

图4 料液比对多酚得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on yield of polyphenol

2.1.6 提取次数的选择

称取石榴皮粉2g，按1∶20g/mL的料液比加入体积分数为50%的丙酮溶液。在40℃的条件下，用200 W的超声波提取30min，离心，所得沉淀按上述提取方法再次进行提取，合并多次提取所得上清液，浓缩，测定提取液中多酚含量，计算其得率，结果见图5。由图5可知：提取2次时，多酚得率最高，说明多酚物质几乎全部浸出。而提取3次、4次多酚得率反而下降，这主要是由于提取所用累计时间比较长，导致多酚氧化受损。此外，每次提取时需要消耗溶剂，这增加了浓缩时的能耗，因此，从成本和时间考虑，选择提取2次较为合适。

图5 提取次数对多酚得率的影响Fig.5 Effect of extraction times on yield of polyphenol

2.2 正交试验结果与分析

根据单因素试验结果，以多酚得率为主要考查指标，采用L9（34）正交试验考察丙酮体积分数（A）、提取时间（B）、提取温度（C）和料液比（D）对石榴皮多酚提取的影响，结果及极差分析见表3和表4。由表3和表4可知，各因素对多酚得率的影响次序从大到小依次为丙酮体积分数、料液比、提取时间、提取温度。新疆石榴皮多酚的最佳提取工艺条件为A2B3C2D3，即丙酮体积分数70%、超声波功率200 W、提取温度40℃、料液比1∶35g/mL、提取时间50min、提取2次，在此条件下，石榴皮多酚得率为23.77mg/g。高于正交试验表中所列最佳组合A1B3C3D3得到的多酚得率，证明本实验确定的提取条件是合理的。

表3 正交试验结果Table 3 Orthogonal experiment and result

表4 正交试验结果极差分析Table 4 Range analysis of error

2.3 石榴皮多酚提取物对酪氨酸酶的抑制作用

取冻干的提取物，配成不同质量浓度的溶液，按表1反应体系分别测定不同浓度的提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用。以提取物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制曲线，结果见图6。由图6可见：随着石榴皮提取物浓度的不断增大，其对酪氨酸酶的抑制作用不断增强。在低质量浓度（2mg/mL）时，抑制率已经达37.31%；当石榴皮多酚提取物质量浓度达到12mg/mL时，对酪氨酸酶的抑制率为44.05%，仅增加了6.74%。说明随着石榴皮多酚提取物浓度的增加，其对酪氨酸酶的抑制作用增加缓慢，推测石榴皮提取物对酪氨酸酶的抑制作用已达到稳态。阳性对照曲酸（1.0mg/mL）的酶活抑制率是93.7%，与其相比，石榴皮多酚提取物对酪氨酸酶也具有较好的抑制效果，有可能成为一种新型功能性化妆品添加剂应用于美白化妆品中。

图6 石榴皮多酚提取物对酪氨酸酶的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of polyphenol extract from pomegranate peel on activity of tyrosinase

3 结论

1）通过单因素试验和正交试验，确定了超声波辅助法提取新疆石榴皮多酚最佳的工艺参数：丙酮体积分数70%、超声波功率200 W、提取温度40℃、料液比1∶35g/mL、提取时间50min、提取2次，在此条件下，石榴皮多酚得率为23.77mg/g。

2）新疆石榴皮多酚提取物对蘑菇酪氨酸酶的二酚酶具有较强的抑制作用，当提取物质量浓度为12mg/mL时，石榴皮多酚对酪氨酸酶的相对抑制率为44.05%。新疆石榴皮多酚提取物可能是潜在的果蔬防褐变剂和皮肤美白剂。

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（责任编辑 荀志金）

Inhibition of tyrosinase activity by polyphenol extracts from Xinjiang pomegranate peel

FU Jianhong1，2，GUO Liyan1，2
（1.Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology，Urmuqi 830054，China；2.College of Life Science，Xinjiang Normal University，Urmuqi 830054，China）

We optimized the extraction process of polyphenol from Xinjiang pomegranate peel and studied its inhibition of tyrosinase activity.Ultrasonic-assisted extraction was used to extract pomegranate peel polyphenol.The best processing condition was obtained by single factor experiment and orthogonal experiment：acetone concentration 70%，ultrasonic power 200 W，extraction temperature 40℃，ratio of the powder to the solution 1∶35g/mL，extraction time 50min，and extraction twice.Under the above conditions，the yield of polyphenol from pomegranate peel was 23.77mg/g.About 44.05%of the tyrosinase activity was inhibited when the concentration of pomegranate peel polyphenol was 12mg/mL. The study provides a candidate of tyrosinase inhibitor from pomegranate peel.

pomegranate peel；polyphenol；tyrosinase；inhibitory effect

Q946.5

A

1672-3678（2015）03-0059-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.011

2014-08-03

新疆维吾尔自治区高校科研计划科学研究重点项目（XJEDU2012I30）；新疆维吾尔自治区教育厅重点实验室项目（XJSD2013-06）；新疆师范大学校级重点学科招标课题（XJMB-1）

付建红（1970—），女，河南平舆人，博士，副教授，研究方向：特殊环境生物多样性及其代谢产物的活性，E-mail：fjh_719@163.com