早期肺癌患者DLC-1基因表达与临床特征研究

高湘湘，林 兰，葛伯建

(南通大学附属肿瘤医院肿瘤内科，江苏南通，226001)

原发性肺癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，2012中国卫生统计年鉴显示肺癌死亡率占据恶性肿瘤死亡率的首位，达到45.57/10万。其中，非小细胞肺癌(NSCLC)约占全部肺癌的80%。抑癌基因失活是肺癌发生、发展的关键步骤［1］。这些基因的异常改变，除与肺癌的发生有关外，还与其浸润、转移和复发有关，间接或直接地影响到肺癌的预后［2］。DLC-1基因，定位于第8号染色体短臂(8p21.3～22)。该基因为大鼠p122基因的人类同源基因，二者有92.5%相似性［3］。作者通过检测DLC-1基因在早期肺癌组织中的表达状况，并与肺癌患者临床特征进行综合分析，来探讨DLC-1基因与肺癌发生、发展的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取江苏省南通市肿瘤医院2012年6月—2014年1月经手术切除并经由病理科确诊的肺癌患者72例，其中男45例，女27例，年龄56～79岁，平均61岁。以正常开胸取得的其他疾病患者的9例良性病变组织作为对照。患者取材前均未接受过放疗和化疗，肝、肾功能正常，排除孕妇、哺乳期妇女、精神疾病患者。每例肺癌标本均有癌旁正常组织作为对照。手术切除标本后立即置入液氮冷却，再转移至－70℃冰箱长期保存。

1.2 主要仪器

U-2001型紫外分光光度计定量(日本日立公司);德国 Biometra温度梯度 PCR扩增仪;ECPS3000/150电泳仪;美国 BECKMAN AllegraTM RA 64R高速低温离心机;美国BIO-RAD公司凝胶图像分析仪。

1.3 总RNA的提取

对晚期肺癌组织、癌旁组织分别提取总RNA，紫外分光光度计定量。总RNA的提取采用OMEGA RNA提取试剂盒提取，具体步骤参照说明书，提取的总RNA立即置于－70℃保存。

1.4 逆转录反应

对肺癌组织、癌旁组织和良性病变组织分别取3μg总RNA按照试剂盒反应体系逆转录。B-actin作为内参照，DLC-1基因及B-act in引物序列合成均由上海生工公司设计合成，DLC-1基因mRNA引物正义链:5'-GCTT GTGAT TGGCTACGG-3'反义链:5'-CCACCTCTTGCTGTCCCT-3'。B-actin mRNA引物(内参)正义链:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'反义链:5'-GTT T TCT GC GCAAGT TAGG-3'。反应条件为:预变性95℃ 5 min，94℃，30 s，温度退火30 s，72℃1 min共35个循环;72℃ 延伸10 min。取5μL扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光照显带观察DLC-1基因的表达状况。

2 结果

2.1 DLC-1基因的表达状况

60例肺癌标本中，22例表达阳性;与之相对应的是癌旁组织49例表达阳性，二者差异有统计学意义(P＜0.01)。9例良性病变组织中，有7例mRNA表达阳性，与肺癌组有显著差异(P＜0.05)。见图1。

图1 DLC-1基因的表达状况显示

2.2 DLC-1基因的表达状况与肺癌临床特征的关系

60例肺癌组织中，DLC-1基因的表达状况随TNM分期及浸润深度增加而下调明显(P＜0.05)。见表1。

表1 DLC-1基因mRNA的表达水平与肺癌患者临床特征的关系

3 讨论

DLC-1基因当前被认为是一个新的抑癌基因，在正常组织中表达基本正常，但在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌及等人类肿瘤中存在表达缺失现象［4－6］。通过 RT-PCR 方法对肺癌组织、癌旁组织和良性病变组织进行DLC-1基因扩增检测，作者发现DLC-1基因的表达缺失与肺癌的发生密切相关。肺癌的癌旁组织标本中，DLC-1基因表达阳性率高达82%，而肺癌组织中仅为37%，二者差异显著(P＜0.01)。9例良性病变组织中，有7例mRNA表达阳性，与肺癌组差异显著(P ＜0.05)。Yuan等［7］研究结果与作者相近，他们报道在超过50%的原发性肝细胞癌组织及大多数细胞系中存在DLC-1基因的缺失，在28%的肝细胞系中检测不到DLC基因的表达。本研究结果为DLC-1基因的低表达在肺癌的发生发展中扮演了重要作用提供了强有力的支持。

本研究将DLC-1基因mRNA的表达水平与肺癌患者临床特征关联后，作者发现DLC-1基因表达的缺失与肿瘤的分期显著相关。对于分期为Ⅰ期的患者，表达阳性与阴性的比例相当，但是对于Ⅱ期和Ⅲ期患者，DLC-1基因表达缺失的比例明显增高，差异有统计学意义。

越来越多的研究［8－11］显示，DLC-1 基因符合抑癌基因的标准。DLC-1定位于人类染色体8p21-22，这一区域在很多恶性肿瘤中经常发生缺失，如肠癌、肝癌、前列腺癌等。所有这些证据表明，通过基因组表达缺失或者DNA甲基化，DLC-1可能是肿瘤细胞中基因表达失活的高发位点。Wilson等［12］在DLC基因上选取了3个微卫星位点，对100例原发性肝癌组织进行了杂合性缺失分析，结果3个微卫星位点的杂合性缺失率分别为44.3%、44.4%和50%，结果表明在原发性肝细胞癌中DLC-1等位基因的缺失为常见现象。

虽然已知DLC-1基因失活在肺癌发生中起着重要作用，但是目前尚未明确其具体的失活机制。迄今为止，在人类肝细胞癌和乳腺癌中发现了DLC-1基因的缺失，在肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌和前列腺癌中都发现了DLC-1启动子区域的DNA甲基化异常［13］。DLC-1基因的点突变仅仅发生在几种不同的实体肿瘤亚群中，表明点突变并不是肺癌中DLC-1基因失活的主要机制［14］。

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