Box—Behnken效应面法优化玄参的提取工艺

孙莉君　马婧　杨静　胡海涛　王越

【摘要】目的：应用Box-Behnken效应面法优化玄参的提取工艺。方法：以乙醇体积分数、溶媒比、提取时间为自变量，以总评“归一值”（包括安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷的含量及浸膏率）作为因变量，对自变量的各个水平采用二项式拟合，用Box-Behnken效应面法对提取工艺进行优化。结果：玄参的最优提取工艺为：提取时间75min，溶媒比为8倍，82%的乙醇，提取2次。二项式拟合复相关系数高（r=0.9777），回归模型的预测值与测定值的偏差率为-2.51%。结论：Box-Behnken效应面法优选的玄参提取工艺，合理可行，操作简便。

【关键词】玄参；提取工艺；Box-Behnken效应面法

【中图分类号】R284.2【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2015）20-0011-03

OptimizationofExtractionTechnologyforRadixScrophulariaebyBox-BehnkenResponseSurfaceMethodology

SUNLijun1MAJingi1YANGJing1HUHaitao2WANGYue1

1.DaqingPeoplesitalHeilongjiangDaqing163316China；

2.DaqingMunicipalFoodandDrugInspectionCenterHeilongjiangDaqing163316China

Abstract：Objective：TooptimizeextractiontechnologyofRadixScrophulariaebyBox-Behnkendesign.Methods：Totaketheextractiontime，solventratioandtheethanolconcentrationasindependentvariables，andtakeoveralldesirabilityasdependentvariable（includingthecontentofangorosideC，harpagide，harpagosideandextractyield），binomialformulawasusedtofiteachlevelofindependentvariables，optimizingextractionprocessbyBox-Behnkendesignandpredictionwascarriedoutthroughcomparingobservedandforecastedresults.Results：Optimalextractiontechnologyasfollows：extracted2timesfor75minuteseachtimewith8timesamountof82%ethanol.Regressioncoefficientofbinomialfittingcomplexmode1wasashighas0.9777.Biasbetweenobservedandpredictedvalueswas-2.51%.Conclusion：OptimalextractionprocessofRadixScrophulariaewasstableandreasonable.

Keywords：RadixScrophulariae；extractionproces；Box-Behnkenresponsesurfacemethod

玄参（RadixScrophulariae）为玄参科（Scrophulariaceae）玄参属植物玄参（ScrophularianingpoensisHemsl.）的干燥根[1]。玄参味甘、苦、咸，性微寒，具有清热凉血，泻火解毒，滋阴的功效。临床主要用于温邪入营，内陷心包，温毒发斑，热病伤阴、舌绛烦渴等症。现代研究发现，玄参根中含生物碱、糖类、氨基酸、甾醇、脂肪酸等成分[2]，具有保肝[3]、降血压、保护心脏[4]、抗菌[5]、降血糖[6]等多种药理活性。为了合理利用玄参的药用资源，实验以玄参中主要药效成分安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷的含量及浸膏率为考察指标，应用Box-Behnken响应面法对玄参进行工艺优化，旨在为玄参的合理应用与开发提供实验依据。

1仪器与材料

1.1仪器LC-20AT型高效液相色谱仪（N2000双通道色谱工作站，日本岛津）；METTLERME104电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；101A-3B型电热恒温鼓风干燥箱（武汉亚华电炉有限公司）、PL-S30型超声波清洗器（东莞康士洁超声波科技有限公司）。

1.2材料玄参药材购自黑龙江省药材公司，经大庆食品药品检验中心鉴定为玄参科植物玄参（ScrophularianingpoensisHemsl.）的干燥根。哈巴俄苷对照品（批号：111730-201205，中国食品药品检定研究院）；安格洛苷C对照品（批号：061209）、哈巴苷对照品（批号：090320）均购自上海尚谊化工科技有限公司。乙腈为色谱（天津恒兴化学试剂制造有限公司），水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷含量的测定

2.1.1色谱条件色谱柱：Phenomenexluna（250mm×4.6mm，5.0μm）；流动相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0～5min，A：5%→30%；5～7min，A：30%→50%；7～20min，A：50%→60%；20～25min，A相60%→75%）；检测波长：哈巴俄苷、安格洛苷C为280nm，哈巴苷为210nm；流速：1.0ml/min；进样量：10μl，柱温：35℃。

2.1.2混合对照品溶液的制备精密称取安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷对照品适量，置于5ml量瓶，用甲醇溶解后稀释到刻度，摇匀，即制成安格洛苷C0.62mg/ml，哈巴苷0.46mg/ml，哈巴俄苷0.58mg/ml的混合对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备精密称取玄参5g，置于250ml圆底烧瓶，加适量乙醇，回流法提取适当时间，过滤，残渣同法提取，合并滤液后减压浓缩，甲醇溶解并定容至20ml，摇匀，过微孔滤膜，即得。

2.1.4线性关系考察精密吸取“2.1.2”项下的混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置10ml量瓶，甲醇定容，摇匀。取10μl按“2.1.1”色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，制作标准曲线，得回归方程如下：哈巴苷Y=95384X+226941（r=0.9997），在0.023～0.46mg范围内线性关系良好；安格洛苷CY=592655X-43685（r=0.9998），在0.031～0.62mg范围内线性关系良好；哈巴俄苷Y=536974X+201232（r=0.9993），在0.029～0.58mg范围内线性关系良好。

2.1.5精密度试验取“2.1.2”项下混合对照品溶液10μl，重复进样6次，按上述色谱条件测定，结果哈巴俄苷、哈巴苷、安格洛苷C峰面积的RSD值分别为1.3%、0.98%、1.25%，表明该仪器精密度良好。

2.1.6稳定性试验精密吸取同一供试品溶液，分别于0、3、6、12、24h进样测定，结果哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C峰面积的RSD分别为1.26%、1.05%、0.91%，说明该样品在24h内稳定。

2.1.7重复性试验称取同一样品，平行制备得到供试溶液6份，按上述色谱条件测定，结果哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C含量平均值（n=6）分别为2.62%、0.285%、0.183%，RSD分别为0.99%、1.2%、1.4%，表明该方法具有良好重复性。

2.1.8加样回收率试验分别精密称取9份已知哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C含量的玄参药材粗粉各5g。分别准确加入哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C对照品溶液适量，制备低、中、高三个质量浓度样品，按上述“2.1.3”项下制备供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件测定。哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C平均回收率分别为98.27%（RSD为1.3%）、101.5%（RSD为1.7%）、100.8%（RSD为1.6%）。说明该方法回收率良好。

2.2玄参提取工艺的优选

2.2.1试验设计在单因素实验基础上选取乙醇体积分数、溶媒比、提取时间和提取次数为考察因素。由于提取次数属于非连续变量，难以回归分析，结合实际应用及文献[7-9]，将提取次数定为2次。每个自变量的低、中、高水平分别以-1，0，1进行编码，因素水平见表1。以玄参中主要有效成分哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C的含量及浸膏得率为评价指标，试验安排及结果见表2。采用“归一化法”[10]和Hassan方法[11]对各指标进行数学转换，计算公式如式①：

di=（Yi–Ymin）/（Ymax–Ymin）

①

总评“归一值”（overalldesirability，OD），计算公式如式OD=（d1×d2……dn）1/n

②

表1Box-Behnken因素设计水平

表2Box-Behnken试验设计及结果

2.2.2模型和方差分析使用Design-Expert7.0软件进行二项式拟合，模型如下：

Y=0.55+1.25×10-3X1+0.14X2-0.15X3+0.045X1X2-0.099X1X3+0.035X2X3-0.086X12-0.087X22-0.16X32（r=0.9777）

由表3可知，提取时间和溶媒比对结果的影响非常显著，X32的偏回归系数非常显著，X12和X22的偏回归系数显著。模型拟合检验结果非常显著能够说明该方程较为符合实际情况。回归方程失拟检验不显著，说明模型误差较小，模型可用。

表3回归方程的方差分析

2.2.3工艺条件优化与预测根据二次多项式模型，作响应曲面图，根据所拟合的响应曲面形状，乙醇体积分数、提取时间、溶媒比对玄参中各主要成分含量及浸膏得率的影响，响应面图见图1～3。根据已建的模型，得最佳条件为提取时间74.66min，溶媒比7.86倍，体积分数为82.11%。考虑实际生产情况及操作的可行性，将各因素条件进行微调，最终确定玄参最佳提取工艺为溶媒比8倍，乙醇体积分数82%，提取2次，每次75min。

2.2.4验证试验按照以上得到的最佳工艺条件进行验证试验（n=3），结果得到安格洛苷C含量为0.236%（RSD为2.36%）；哈巴苷含量为3.136%（RSD为1.96%）；哈巴俄苷含量为0.362%（RSD为1.82%）；浸膏得率为22.18%（RSD为1.69%）；总评归一值为0.622，最大预测值为0.638，偏差率为-2.51%，说明本模型可靠，具有较好的预测性。

3讨论

目前，中药及复方的提取工艺多采用正交设计和均匀设计，但二者的实验次数偏少，存在精度低的缺点[12]。响应面法因模型拟合度高，实验结果准确，在中药及复方的提取工艺中越来越受到关注。实验采用Box-Behnken效应面法对玄参的提取工艺进行了优化，得到的结果准确，模型预测性良好，为玄参的工业化提取提供了实验依据，同时也为起临床的合理应用奠定了基础。

参考文献

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（收稿日期：2015.07.17）