针刺太阳、风池穴对脑缺血再灌注家兔热休克蛋白70及细胞凋亡的影响

赵军,兰惠羽

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院,哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040)

脑缺血再灌注损伤是在缺血性损伤的基础上发展而来的,病理生理过程复杂,涉及到氧自由基增多、钙超载、微血管损伤和细胞功能代谢障碍等多个环节[1-3]。因此,阐明脑缺血再灌注损伤的机制和寻找有效的治疗靶点已成为目前亟待解决的重要课题。近年来实验研究表明针刺对脑缺血再灌注损伤具有显著的保护作用,日益受到关注[4-6]。

太阳穴和风池穴是临床上针刺治疗缺血性脑卒中主要的穴位,合称为“头四关穴”。本研究通过电针“头四关穴”对缺血再灌注家兔脑组织中HSP70蛋白表达和细胞凋亡的影响,探讨其对神经细胞保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

54只健康雄性新西兰白兔,清洁级,4～5月龄,体重为2.5～3.0 kg,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。随机分为假手术组、模型组和针刺组,每组 18只。每组根据再灌注1、3、7 d 3个时间点,随机各取6只。所有动物自由进食和水,12 h昼夜节律喂养。

1.2 主要试剂及仪器

HSP70免疫组化一抗,购自武汉博士德生物工程有限公司;细胞凋亡(Tunnel法)检测试剂盒,购自美国Roche公司;PV二步法试剂和DAB显色剂,购自北京中杉金桥生物公司。其他为国产分析纯。

仪器为德国菜卡2135型组织切片机;美国motic公司 moticam 3000显微摄影成像系统;Image-pro plus6.0病理图像分析系统;上海安亭台式离心机。

1.3 动物模型的制备

[7-9],采用线栓法建立家兔局灶脑缺血再灌注损伤模型。先将直径为0.285 mm的3号尼龙线剪成10 cm长,在距一端0.5～1.0 cm处均匀涂上硅橡胶,控制线栓头端直径在0.51～0.55 mm,并在距离线栓头端6.0 cm处做标记。

家兔术前禁食 12 h,称重后自耳缘静脉缓慢注射20 g/L的乌拉坦(5 mL/kg)麻醉,常规消毒后,颈部正中切口,暴露出左侧颈总动脉(CCA)及分叉,并分离出近段颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。暂时夹闭 CCA和ICA,结扎ECA并于近端将其剪断,将线栓经ECA残端向ICA内缓缓送入,松开ICA动脉夹。当线栓进入大脑中动脉(MCA)起始部遇阻力时停止,记录造成大脑中动脉闭塞(MCAO)时间。记算线栓插入深度,并将 ECA残端及线栓一同结扎固定。再灌注时,用镊子夹住线栓外露残端轻轻向外拉出,遇到明显阻力感停止牵拉,记录时间作为再灌注开始时间。结扎颈内动脉,彻底止血后缝合切口。

假手术组家免除不栓塞大脑中动脉外,其余处理同模型组和针刺组。参照文献[10-11]中的评分法,0分为无神经缺损症状;1分为右前肢屈曲;2分为向右旋转;3分为向右倾倒;4分为不能行走或昏迷。其中1～4分为有效模型,纳入实验分组。

1.4 干预方法

参考实验针灸学[12],选取家兔“头四关穴”,即双侧太阳穴和风池穴。用长40 mm毫针,太阳穴水平向后斜刺5 mm,风池穴向后下方斜刺5 mm。针刺后,双侧太阳及风池穴连接电针仪,频率为 2 Hz,采用连续波,刺激强度以针柄震颤且家兔安静不挣扎为度,治疗时间为30 min。针刺组在造模成功后6 h开始首次针刺,各时间点疗程分别为1 d、3 d和7 d。每日1次。假手术组和模型组家兔除不针刺外,每日同样抓取。

1.5 指标检测

各组家免于相应时间点乌拉坦( 5 mL/kg)麻醉后,心脏取血分离血清。然后用4%的多聚甲醛PBS液进行心脏灌注固定后取脑,自视交叉向前后各取厚 2.5 mm的冠状脑片,常规石蜡包埋,连续切片备用。

HE染色观察各组家兔脑组织缺血区病理变化;免疫组化PV二步法检测缺血区周围脑组织HSP70蛋白表达,Tunnel法检测缺血区周围脑组织中神经细胞凋亡情况,按说明书进行操作。免疫组化和细胞凋亡分析采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统,每张切片于梗死灶周围选择10个表达最强的高倍视野(400倍)计算阳性细胞数。

1.6 统计学方法

采用SPSS18.0软件进行统计处理,实验数据以均数±标准差表示,多组数据比较使用单因素方差分析,两两比较用t检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病理形态学观察

假手术组脑组织均未见明显病理改变。模型组家兔左侧大脑皮质及基底核区可见明显的梗死灶,缺血中心区神经纤维呈网格状改变,神经元数量明显减少;缺血区周围脑组织水肿,炎细胞增多;神经元变性坏死,细胞核固缩或溶解,胞浆呈嗜酸性变;胶质细胞明显增多;上述病理改变以3 d时最为明显。针刺组各时间点与模型组各时间点相比,梗死灶均有不同程度减小,梗死灶内神经元数量明显增多,脑水肿和炎细胞浸润明显减轻;缺血周围神经元形态均有不同程度的改善。

2.2 脑组织HSP70表达

HSP70蛋白主要表达在神经元胞质中,阳性细胞呈现淡黄色、黄色或棕黄色。假手术组HSP70阳性细胞数目较少,颜色较淡。模型组各时间点HSP70蛋白表达阳性细胞数目明显增多,且颜色较深,与假手术组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。针刺组各时间点 HSP70蛋白表达阳性细胞数目明显增多,且颜色较深,与假手术组和模型组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。 详 见 表 1、 图 1-3。

表1 各组脑组织HSP70蛋白表达阳性细胞数目比较(±s,个)

表1 各组脑组织HSP70蛋白表达阳性细胞数目比较(±s,个)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01

组别 n 再灌注1 d 再灌注3 d 再灌注7 d假手术组 6 11.05±1.87 9.51±2.43 11.01±2.37模型组 6 23.83±1.721) 18.51±1.871) 15.17±1.161)针刺组 6 32.00±3.031)2) 26.84±1.171)2) 21.33±1.631)2)

图1 假手术组HSP70组化示意图

2.3 脑组织细胞凋亡

图2 模型组HSP70组化示意图

图3 针刺组HSP70组化示意图

TUNEL主要标记在神经元及胶质细胞细胞核中,呈黄色或棕黄色。假手术组凋亡细胞数目较少。模型组各时间点凋亡细胞数目随再灌注时间的延长而逐渐增多,至3 d达高峰,与假手术组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01)。针刺组各时间点凋亡细胞数明显减少,优于假手术组和模型组(均P＜0.01)。见表2、图4-6。

表2 各组TUNEL表达阳性细胞数比较 (±s,个)

表2 各组TUNEL表达阳性细胞数比较 (±s,个)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01

组别 n 再灌注1 d 再灌注3 d 再灌注7 d假手术组 6 6.00±1.41 5.33±1.21 6.67±1.21模型组 6 17.66±1.631) 29.17±2.791) 25.16±1.471)针刺组 6 12.84±1.941)2) 18.00±1.421)2) 13.00±1.521)2)

图4 假手术组TUNEL示意图

图5 模型组TUNEL示意图

图6 针刺组TUNEL示意图

3 讨论

HSP70是热休克蛋白家族中含量最高和最保守的一类蛋白,在细胞的信息传递、生长和分化中起到重要的调控作用,同时对细胞的损伤能产生自我保护作用,被认为是评价缺血性脑损伤程度的重要指标。在机体缺血缺氧、创伤和氧化应激等过程中,中枢神经系统内HSP70含量明显增加,在脑缺血早期对神经元起到保护的作用,而缺血后期对神经细胞损伤的修复有着重要作用[13]。

临床研究表明,针刺风池可以改善大脑的缺血缺氧状况,增加脑血流量,改善脑部血液循环功能,可以诱导脑细胞的缺血耐受机制,降低外周血管阻力,改善微循环和侧支循环,减轻脑组织损伤,对脑缺血性疾病具有较好的治疗作用[14]。针刺“头四关穴”可显著改善偏头痛患者的脑血流速度与状态,降低偏头痛患者的血浆ET、NO水平,调节患者血浆内5-HT含量。另有研究[15]表明,针刺“头四关穴”对缺血性脑卒中患者有较好的治疗作用,其作用机制可能是通过调节血浆中ET-1的含量。

本实验免疫组化结果显示,模型组 HSP70蛋白阳性表达细胞数目明显增多,针刺“头四关穴”后各时间点HSP70蛋白阳细胞数较模型组均明显增加。病理和细胞凋亡结果表明,模型组家兔左侧脑组织呈网格状改变,梗死灶明显,神经细胞凋亡数量明显增加,脑神经细胞损伤程度较重。针刺组各时间点的梗死灶均有不同程度减小,神经元数量明显增多,神经细胞凋亡数量明显减少,脑组织缺血性损伤有一定程度改善。

我们推测脑缺血再灌注后,损伤的脑组织中产生大量的氧自由基和兴奋性氨基酸等对神经细胞有毒性作用的物质,并且通过级联反应诱导细胞凋亡的发生,加重了神经细胞损伤程度[16]。针刺“头四关穴”能够改善缺血再灌注损伤后脑组织血流量和血流状态,通过提高缺血后脑组织中 HSP70蛋白表达,调控氧自由基和兴奋性氨基酸等产生的毒性级联反应,从而抑制了神经细胞凋亡起到神经保护作用。

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