响应面法优化葡萄酒泥酵母甘露聚糖提取工艺条件

李　　颍，杨　　婷，祝　　霞，韩舜愈，杨学山

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070）

响应面法优化葡萄酒泥酵母甘露聚糖提取工艺条件

李颍1，杨婷1，祝霞1，韩舜愈1，杨学山2，*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070）

目的：优化热水浸提法提取葡萄酒泥酵母甘露聚糖工艺条件。方法：在单因素实验基础上，采用Box-Behnken实验设计，对影响热水浸提甘露聚糖的主要因素进行研究。结果：热水浸提法提取葡萄酒泥酵母甘露聚糖的最佳工艺条件为料液比1∶23（g/mL），浸提温度124℃，浸提时间5 h，浸提次数3次。在此条件下甘露聚糖得率为14.27%，提取效果最佳。结论：此方法绿色环保，成本低，适宜工业化生产。

葡萄酒泥酵母，甘露聚糖，热水浸提，得率

随着葡萄酒产业的快速发展，葡萄酒副产物的资源化开发利用已引起高度关注［1］。据统计每生产100 kL葡萄酒，大约形成2.5～4.0 t葡萄酒泥酵母［2-3］。葡萄酒泥酵母含有丰富的甘露聚糖，占酵母细胞壁干重的35%～45%［4］。甘露聚糖是动物机体发挥细胞免疫和体液免疫的有效诱导物［5］，具有结合外源性病原体、抗肿瘤、抗辐射等功效［6］，并能作为抗氧化剂来阻断自由基的氧化损伤［7-8］。此外，酵母甘露聚糖应用于葡萄酒中可以起到稳定酒石、蛋白质，提高气味和口感，提升葡萄酒品质，是一种极具开发潜力的多糖［9-11］。

利用葡萄酒泥酵母开发甘露聚糖，不仅可以大大降低原料生产成本，而且可保护生态环境，具有良好的经济和社会效益。传统制备酵母多糖的方法主要以全细胞为原料，不仅酸碱用量大、污染环境，而且会引起多糖降解，影响其生理活性［12］。本实验以诱导自溶后的酵母细胞壁为原料，采用清洁、安全、操作简单、易工业化生产的高温热水浸提法制备酵母甘露聚糖，以甘露聚糖得率为评价指标，通过响应面法优化甘露聚糖提取工艺，旨在为开发利用葡萄酒泥酵母甘露聚糖提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

葡萄酒酵母泥甘肃祁连葡萄酒业有限公司；甘露糖标准品上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99%；醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、三氯乙酸、无水乙醇、丙酮、乙醚、浓硫酸、硼酸均为分析纯。

HH-6型数显恒温水浴锅国华电器有限公司；TDZ5-WS型湘仪离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；SL-1001型电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司；PHS-3C型pH计上海雷磁有限公司；TU-1810型紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂。

1.2实验方法

1.2.1工艺流程葡萄酒泥→预处理→诱导自溶→热水浸提→脱蛋白→乙醇醇析（室温下2倍体积乙醇醇沉12 h）→丙酮、乙醚洗涤（2次）→干燥（60℃干燥10 h）→成品。

操作要点：

葡萄酒泥的预处理：收集葡萄酒酒泥，与蒸馏水以1∶1混合，用80目筛筛分，4000 r/min离心15 min。重复上述步骤，直至所得沉淀为白色，上清液无色透明为止，收集湿酵母备用［13］。

自溶：取5.0 g酵母悬浮于30 mL添加质量分数为2%NaCl、pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，47.5℃诱导自溶33 h。

提取：自溶后4000 r/min离心15 min获得酵母细胞壁，称取2.5 g细胞壁，添加蒸馏水配成不同的料液比，并在不同的温度及时间下浸提不同次数。

脱蛋白：向提取后获得的含有甘露聚糖的上清液中加入质量浓度9%的三氯乙酸溶液调节pH为3，4℃静置12 h，以除去其中的蛋白质［14］。

1.2.2单因素实验设计分别对浸提温度、浸提时间、料液比、浸提次数进行单因素实验，重复3次。以甘露聚糖成品得率为评价指标，为响应面优化实验选择因素水平。

1.2.2.1浸提温度对甘露聚糖得率的影响取5份各2.5 g酵母自溶后细胞壁，添加蒸馏水配成料液比为1∶25（g/mL）的悬浮液，分别于85、95、105、115、125℃（高于100℃时用高压灭菌锅实现）下浸提4 h，4000 r/min离心15 min后沉淀再次在相同条件下提取；合并两次上清液，用三氯乙酸溶液调节pH为3，4℃静置12 h后，4000 r/min离心15 min脱蛋白，向上清液中加入2倍体积无水乙醇醇沉12 h，4000 r/min离心15 min取沉淀，分别用20 mL丙酮、乙醚洗涤2次，每次15 min；60℃干燥得甘露聚糖成品。取20 mg样品进行甘露聚糖质量浓度的测定。

1.2.2.2浸提时间对甘露聚糖得率的影响取5份各2.5 g酵母自溶后细胞壁，添加蒸馏水配成料液比为1∶25（g/mL）的悬浮液，于115℃下分别浸提2、3、4、5、6 h；后续步骤同1.2.2.1，取20 mg样品进行甘露聚糖质量浓度的测定。

1.2.2.3料液比对甘露聚糖得率的影响取5份各2.5 g酵母自溶后细胞壁，添加蒸馏水配成料液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）的悬浮液，于115℃下高温浸提4 h；后续步骤同1.2.2.1，取20 mg样品进行甘露聚糖质量浓度的测定。

1.2.2.4浸提次数对甘露聚糖得率的影响取5份各2.5 g酵母自溶后细胞壁，添加蒸馏水配成料液比为1∶20（g/mL）的悬浮液，于115℃下浸提4 h，分别提取1、2、3、4、5次；后续步骤同1.2.2.1，取20 mg样品进行甘露聚糖质量浓度的测定。

1.2.3响应面优化实验在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，以甘露聚糖得率为响应值，设计4因素3水平的响应面分析实验，优化提取条件。

表1　响应面优化实验因素水平表Table 1　Levels and factors for the response surface optimization test

1.2.4甘露聚糖含量测定方法采用紫外分光光度法［15］。

1.2.4.1标准曲线的制作参照文献［16］的方法，准确配制甘露糖质量浓度分别为25、50、75、100、125、150、175、200 μg/mL的系列溶液绘制标准曲线。

1.2.4.2样品处理称取20 mg左右的酵母甘露聚糖，不断碾磨使其溶解于2.5 mL 72%H2SO4中，室温放置3 h，加蒸馏水使硫酸的最终浓度为4 mol/L，然后100℃酸水解4 h，取出冷却至室温，用NaOH调pH至中性，再用0.2 mol/L pH7.0磷酸缓冲液定容至100 mL并摇匀［16］。

1.2.4.3样品甘露聚糖质量浓度的测定吸取0.2 mL样液，按1.2.4.1步骤操作在280 nm处测吸光值，求得△OD，以标准曲线计算甘露糖质量浓度，最终得出甘露聚糖质量。

1.2.5甘露聚糖得率的计算

1.2.6统计分析采用SPSS 18.0软件进行实验数据分析。

2　结果与分析

2.1标准曲线的制备

以甘露糖为标准样品，紫外分光光度法制作标准曲线如图1所示。标准曲线方程为y=0.0013x+ 0.0021（y为△OD；x为甘露糖质量浓度，μg/mL），相关系数R2=0.9974。

2.2单因素结果与分析

2.2.1浸提温度对甘露聚糖得率的影响由图2可知，在115℃时，甘露聚糖得率达到最大值9.38%，所以选择115℃为提取甘露聚糖的较佳温度。当温度小于115℃时，甘露聚糖得率随温度的升高几乎呈直线上升，说明温度对甘露聚糖的提取影响明显。在温度较低时，很难诱发酵母细胞壁上化学键的充分断裂，影响甘露聚糖的提取；当温度高于115℃时，得率有轻微下降，可能是由于温度过高，破坏了糖的结构，导致甘露聚糖得率下降。

2.2.2浸提时间对甘露聚糖得率的影响由图3可知，浸提时间为4 h时，甘露聚糖得率最大，达到9.81%，因此选择4 h为提取甘露聚糖的较佳时间。当浸提时间大于或小于4 h时，都会使甘露聚糖得率下降，造成该结果可能是由于时间较短时，反应不充分，提取不彻底；时间过长，导致甘露聚糖降解，得率降低。

图1　甘露糖标准曲线Fig.1　Standard curve of mannose

图2　浸提温度对甘露聚糖得率的影响Fig.2　Effect of different temperature on the yield of mannan

图3　浸提时间对甘露聚糖得率的影响Fig.3　Effect of different time on the yield of mannan

2.2.3料液比对甘露聚糖得率的影响由图4可知，当料液比为1∶20（g/mL）时，甘露聚糖得率最大，达到10.08%，所以1∶20（g/mL）为热水浸提甘露聚糖的较佳料液比。料液比小于1∶20（g/mL）时，甘露聚糖得率呈上升趋势，根据固液萃取基本理论，溶剂的增多，有利于溶质的析出。但过大的料液比不仅增加了水的消耗，而且容易导致后续处理过程中溶质的丢失。

图4　料液比对甘露聚糖得率的影响Fig.4　Effect of different solid-liquid ratio on the yield of mannan

2.2.4浸提次数对甘露聚糖得率的影响由图5可知，浸提次数为2次时，甘露聚糖得率最大，达到10.34%，提取效果最好，所以选择2次为提取的较佳浸提次数。当浸提次数小于2次时，提取不彻底，甘露聚糖尚未完全溶于浸提液中；当浸提次数大于2次时，尽管总糖量有所增加，但所测总糖中甘露聚糖的含量却是降低的，究其原因，可能是高温长时间的处理过程导致甘露聚糖的结构发生了破坏，最终使获得的甘露聚糖得率下降。

图5　浸提次数对甘露聚糖得率的影响Fig.5　Effect of different extraction times on the yield of mannan

2.3响应面实验设计及结果

2.3.1回归模型的确定利用Design-Expert 7.0软件对表2进行二次多项回归拟合实验和方差分析，反映料液比、浸提温度、浸提时间和浸提次数对甘露聚糖得率的影响，拟合所得多元二次回归方程如下：

Y=-253.0546+3.5787X1+4.7001X2+16.3074X3-18.4378X4-6.5000X1X2+0.0665X1X3-0.0165X1X4+ 0.0198X2X3+0.1803X2X4+1.3050X3X4-0.0922X12-0.0211X22-2.7403X32-1.2553X42

该方程复相关系数R2为0.9785，响应变量R2为0.9571，因此，可以充分描述独立变量对甘露聚糖得率的影响。该模型prob（P）＞F值为0.0001，模型极显著，模型拟合程度良好。

2.3.2回归方程的方差分析由表3可以看出，甘露聚糖得率方程的一次项（除X1外）和二次项极其显著（p＜0.01），说明各具体因素对响应值的影响不是简单的线性关系。交互项X2X4、X3X4极其显著（p＜0.01），说明X2和X4，X3和X4之间的交互作用极显著，整个响应面基于各因素间的交互作用构成。另外，模型的变异系数C.V.为9.84%，证明回归方程拟合程度较好，说明实验具有很高的可信性和准确性。失拟项不显著，说明实验的误差很小。

各因素的影响程度分析，各因素的F值可以反映各因素对实验指标的重要性，F值越大，表明对实验指标的影响越大。从方差分析表可知各因素对甘露聚糖得率的影响程度大小顺序为：浸提温度＞浸提次数＞浸提时间＞料液比。

2.3.3各因素之间的交互作用根据回归方程做出响应面分析图，考察所拟合的响应曲面的形状，反映料液比、浸提温度、浸提时间、浸提次数对响应值的影响。观察曲面的倾斜度确定两因素对响应值的影响程度，倾斜度越高，说明两者交互作用越显著。

表2　Box-Behnken响应面实验结果Table 2　Results of Box-Behnken response surface experiments

表3　回归方程各项的方差分析Table 3　Variance analysis for each item of the regression equation

由图6及回归方程方差分析可知，因素X2与X4，X3与X4交互作用显著，而X1与X2、X1与X3、X1与X4及X2与X3之间的交互作用不显著。

2.3.4验证实验及结果分析由响应曲面图以及回归方程分析可知，热水浸提法提取葡萄酒泥酵母甘露聚糖的最佳工艺条件为料液比1∶22.6（g/mL），浸提温度123.84℃，浸提时间4.98 h，浸提次数2.63次。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件提取酵母甘露聚糖，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为料液比1∶23（g/mL），浸提温度124℃，浸提时间5 h，浸提次数3次。按上述条件进行实验结果的验证，重复3次实际测得的甘露聚糖的得率分别为13.93%、14.63%、14.25%，平均得率为14.27%，与理论预测值（14.00%）相比，其相对误差约为1.86%。说明通过响应面优化得到的回归方程具有一定的实践指导意义。

3　结论

本实验采用热水浸提法对葡萄酒泥酵母甘露聚糖进行提取，通过单因素实验及Box-Behnken中心组合设计原理以及响应面分析法对提取工艺进行优化，拟合了料液比、浸提温度、浸提时间、浸提次数4因素对甘露聚糖得率的回归模型，经检验证明该模型合理可靠，能较好的预测葡萄酒泥酵母中甘露聚糖的得率。由该模型确定的最优工艺条件为料液比1∶23（g/mL），浸提温度124℃，浸提时间5 h，浸提次数3次，在此条件下获得的甘露聚糖得率最大，达14.27%。通过模型系数显著性检验，得到各因素对甘露聚糖得率的影响大小顺序为浸提温度＞浸提次数＞浸提时间＞料液比。

图6　料液比、浸提温度、浸提时间和浸提次数对甘露聚糖得率影响的响应面Fig.6　Effect of response surface of solid-liquid ratio，extraction temperature，time and times on the yield of mannan

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Optimization of extraction conditions of mannan from waste wine yeast by response surface methodology

LI Ying1，YANG Ting1，ZHU Xia1，HAN Shun-yu1，YANG Xue-shan2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College of Life Science&Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Objective：To optimizing process condition of mannan from waste wine yeast by hot water extraction. Method：The main factors affecting mannan yield were studied by using Box-Behnken experimental design based in single factor experiments.Result：The results showed that the optimal conditions were：solid-liquid ratio 1∶23（g/mL），extracting temperature 124℃，extracting time 5 h，extracting times 3.Under these conditions，the yield of mannan reached 14.27%and the effect of extracting was the best.Concultion：This method was green，beneficial for environmental protection，inexpensive and applied to industrialized production.

wine yeast；mannan；hot water extraction；yield

TS209

B

1002-0306（2015）16-0294-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.051

2014－12－05

李颍（1988-），女，硕士研究生，研究方向：农产品加工及利用，E-mail：liying@163.com。

杨学山（1977-），男，副教授，研究方向：生物化学与生物产品研发，E-mail：yangxs@gsau.edu.cn。

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2013-21）。