鳕鱼骨胶原肽的制备及其对成骨样MG-63细胞作用机制的研究

王珊珊，张朝辉，赵　雪，侯　虎，李八方，*（.中国海洋大学，食品科学与工程学院，山东青岛266003；2.中国水产科学研究院，黄海水产研究所，山东青岛26607）

鳕鱼骨胶原肽的制备及其对成骨样MG-63细胞作用机制的研究

王珊珊1，2，张朝辉1，赵雪1，侯虎1，李八方1，*
（1.中国海洋大学，食品科学与工程学院，山东青岛266003；2.中国水产科学研究院，黄海水产研究所，山东青岛266071）

以水产加工下脚料鳕鱼骨为原料，对其进行基本组成分析与组织结构观察。从鳕鱼骨中提取胶原蛋白并酶解制得不同分子量段的胶原肽。探讨不同分子量胶原肽组分对MG-63细胞碱性磷酸酶（ALP）活性及相关因子骨形态发生蛋白（BMP-2）、骨保护素（OPG）与核因子-κB受体活化因子配基（RANKL）mRNA表达水平的影响。结果表明：鳕鱼骨中蛋白质含量较高（14.5%），Van Gieson染色发现鳕鱼骨中含有大量的胶原蛋白纤维。鳕鱼骨胶原肽能够提高细胞ALP活性，同时显著上调细胞BMP-2 mRNA的表达水平；鳕鱼骨胶原肽可有效提高细胞OPG/RANKL mRNA的相对表达量，以间接对破骨细胞的成熟及活化进行调控。鳕鱼骨可作为一种优良的天然蛋白源，鳕鱼骨胶原肽能够作为一种有效的抗骨质疏松营养强化剂加以开发。

鳕鱼骨，胶原肽，酶解制备，成骨细胞

骨质疏松症是一种以骨量低下，骨微结构破坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。为了维持骨的相对稳定状态，在多种激素、细胞因子和其他调节因子的协调作用下，骨组织不断吸收旧骨，生长新骨，骨形成与骨吸收维持在相对平衡的稳定状态。当这种平衡被打破后，骨形成与骨吸收的比例逐渐下降，骨量随之丢失，逐渐发展为骨质疏松。骨重建的失衡是导致骨质疏松症的细胞学基础［1-4］。因此任何物质如果能直接或间接作用于成骨细胞、破骨细胞，在抑制破骨细胞活化的同时刺激骨的形成，则有可能作为促进骨形成和增加骨量的有效途径。目前治疗骨质疏松症的相关药物虽然种类繁多，但是普遍具有一定的副作用，作为预防措施使用时不能长期服用，因此寻找副作用小、可以长期服用的能够预防骨质疏松的生物活性物质已经成为重要的研究方向［5］。

鳕鱼是我国远洋渔业的重要捕捞对象之一，在加工生产过程中会产生大量的废弃物，其中鱼骨约占鱼体重量的15%［6］。鱼骨蕴含丰富的胶原蛋白，是优良的天然蛋白源。谭洪亮等从金枪鱼骨中制备出具有抗氧化活性的胶原肽，对羟自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用［7］。赵玲等［8］酶解制备的鳕鱼骨胶原肽对羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除能力，其中对羟自由基的清除能力最强且有较好的量效关系。陆剑锋等［9］以斑点叉尾鱼骨为原料制备胶原肽螯合钙，其肽钙螯合率达82.53%。因此从鳕鱼骨中制备具有抗骨质疏松活性的胶原肽，不仅可以增加鳕鱼骨的综合利用价值，还可为新型抗骨质疏松营养强化剂的开发提供科学依据，具有十分重要的现实意义。本研究采用商品蛋白酶水解制备鳕鱼骨胶原肽，并探讨其对MG-63细胞增殖、碱性磷酸酶活性，以及对细胞相关因子mRNA表达的影响，为鳕鱼骨胶原肽的生物活性研究和综合开发应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

冷冻鳕鱼（Gadus macrocephalus）鱼排青岛福生食品有限公司；人成骨样MG-63细胞中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；胰蛋白酶（2.4×105U/g），中性蛋白酶（1.8×105U/g）南宁庞博生物工程有限公司；DMEM培养基、胎牛血清美国Gibco公司；碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）测定试剂盒南京建成生物工程研究所；UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、β-actin上海生工生物有限公司；MMLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶普洛麦格生物技术有限公司；DNA marker DL2000 TaKaRa生物工程有限公司。

PHS-2F精密酸度计上海精密科学仪器公司；680型酶标仪美国BIO-RAD公司；BH-2型显微镜OLYMPUS公司；TDL-5大容量低速离心机上海市安亭仪器厂；ZHCHENG恒温培养振荡箱上海智诚仪器制造有限公司；UV-2550型紫外分光光度计日本Shimadzu公司。

1.2实验方法

1.2.1基本组成分析水分测定：恒温干燥法（GB 5009.3-2010）；蛋白质测定：凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）；灰分的测定：灰化法（GB 5009.4-2010）；粗脂肪的测定：索氏抽提法（GB/T 14772-2008）。

1.2.2组织结构观察将鱼骨于中性甲醛中固定24 h，流水冲洗12 h。将固定后的样品置于0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶液（pH7.2）中脱钙5 d。对脱钙鱼骨进行常规石蜡包埋切片，进行Van Gieson染色［10］。

1.2.3鳕鱼骨胶原肽的酶解制备

1.2.3.1鳕鱼骨明胶的制备将鱼排切成5 cm左右，取1 kg原料，加入5 g中性蛋白酶和1000 mL水进行酶解（55℃，pH7.5）2 h。酶解结束后洗去杂质，将鱼骨放入0.1 mol/L NaOH溶液（w/v，1∶10）搅拌24 h，以去除残留的盐溶性蛋白。将清洗后的鱼骨使用4%HCl溶液处理18 h，溶胀结束后鱼骨清洗至中性匀浆。热水抽提温度设置为70℃，提取时间设置为8 h。热水抽提后离心（4000 r/min，15 min）获得上清液，冷冻干燥后得到鳕鱼骨胶原蛋白［11］。

1.2.3.2鳕鱼骨胶原肽的制备将鳕鱼骨胶原蛋白溶液调至浓度为5%，使用1 mol/L NaOH溶液调节溶液pH为8.0。使用胰蛋白酶进行酶解，条件设置为：酶解温度50℃，酶解时间90 min，加酶量1.5%。酶解结束后于沸水浴中灭活5 min，迅速冷却至室温后以4000 r/min离心15 min，取上清液即为鳕鱼骨胶原肽酶解液（Bone Collagen Hydrolysates，BCH）。依次使用截留分子量为2000 U与6000 U的超滤膜截留得到不同分子量的胶原肽溶液，其分子量范围分别为：BCH1：2000 U＜Mw＜6000 U；BCH2：Mw＜2000 U。将溶液透析除盐后冻干备用。

1.2.4对细胞增殖的影响取对数生长期的MG-63细胞，经0.25%胰酶消化后，以DMEM完全培养基调整细胞密度为4×103个/mL的细胞悬液，接种于96孔板。置于37℃、5%CO2的培养箱内培养。贴壁24 h后弃培养液，分别加入含BCH1、BCH2（浓度为12.5、25、50、100、200、500、1000 μg/mL）的完全培养液，对照组加等体积的完全培养液；每一浓度分别有5个复孔。空白调零孔仅加入完全培养液以用于调零。在温度设定为37℃的饱和湿度培养箱（5%CO2）中分别培养24、48 h。每孔加入20 μL噻唑蓝（MTT）溶液（5 g/L），孵育4 h。吸弃每孔的上清液，加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），室温振荡10 min，于酶标仪570 nm波长处测定吸光度A值，计算细胞增殖率。

1.2.5对细胞ALP活性的影响以DMEM完全培养基调整细胞密度为2×104个/mL的细胞悬液，接种于24孔板。贴壁24 h后弃培养液，分别加入含BCH1、BCH2（浓度为200 μg/mL）的完全培养液，在37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养48 h与96 h。对照组加等体积的完全培养基。培养结束后吸取上清液，PBS清洗3遍后在冰浴中对细胞进行超声破碎，按照ALP测定试剂盒说明进行操作，测定细胞ALP活性。

1.2.6对细胞相关因子mRNA表达的影响

1.2.6.1细胞培养以DMEM完全培养基调整细胞密度为2×105个/mL的细胞悬液，接种于6孔板。贴壁24 h后弃培养液，分别加入含BCH1、BCH2（浓度为100、200 μg/mL）的完全培养液。每组设置3个复孔，在37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中连续培养5 d，每2 d换液一次。

1.2.6.2总RNA的提取采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒对培养细胞提取总RNA。取所提取RNA样品4 μL进行稀释，测其在260 nm及280 nm下吸光度A值，确定RNA纯度并计算其含量，电泳检测其完整性。

1.2.6.3逆转录（RT）反应取1 μg样品RNA进行逆转录以得到cDNA，采用25 μL反应体系进行逆转录反应扩增。反应体系包括：Random Primer 1.5 μL，5×Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，M-mlv逆转录酶1 μL，使用DEPC水将总体积补足至25 μL。

1.2.6.4PCR反应取2 μL cDNA模板，采用30 μL反应体系进行PCR扩增。目的基因的引物序列、产物长度、退火温度和循环数如表1所示。反应条件为94℃、45 s变性，Tm退火30 s，72℃、45 s延伸，循环结束后72℃、10 min延伸。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，在100 V恒定电压下进行电泳。使用凝胶成像系统对结果进行检测，采用Image J图像分析软件分析各目的条带的灰度值。内参校正为β-actin，目的基因的相对表达量（%）=目的基因灰度值/β-actin灰度值×100。

表1　目的基因的引物序列、退火温度、循环数和产物长度Table 1　The primer sequence，annealing temperature，cycles number and products length of different genes

1.3统计学分析

2　结果与分析

2.1基本组成分析

如表2所示，鱼骨中粗蛋白含量为14.5%，是具有较高经济价值的蛋白原料。鱼骨中羟脯氨酸含量为1.2%，羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，通过测定羟脯氨酸的含量可以计算出胶原蛋白的大致含量，对水生生物的换算系数一般采用11.1［12］。因此得出鳕鱼骨中胶原蛋白的含量约占原料（湿基）的13.3%，这说明鳕鱼骨是一种良好的胶原蛋白制备原料。

表2　基本成分分析（g/100 g）Table 2　Proximate analysis of samples（g/100 g）

2.2组织结构观察

使用EDTA-2Na溶液（pH7.2）能够将样品中坚固致密的钙盐晶体脱除，露出鱼骨中的有机间质。骨组织的有机间质主要是胶原纤维和无定型基质，其中胶原纤维是骨间质中的有形成分。如图1所示，鱼骨的有机间质主要为胶原蛋白组成的胶原纤维。一般来说，胶原纤维约占骨间质中有机物质的93%，在未矿化的类骨基质中，胶原纤维所占的比例可达96%［13］。从图1中可见，由于钙盐的脱除，有机间质中部胶原纤维呈交错样分布，形成空隙区域。

图1　胶原纤维的组织分布Fig.1　Histological examination of collagen fibril in samples

2.3对细胞增殖的影响

如图2所示，培养24 h时BCH1与BCH2在不同的浓度下对MG-63细胞的增殖并无明显影响（p＞0.05）。培养48 h时在200、500、1000 μg/mL浓度下BCH2表现出显著的促进细胞增殖作用（p＜0.05）。初步说明鳕鱼骨胶原肽没有明显细胞毒害作用，具有较好的安全性。

图2　不同浓度胶原肽（BCH1、BCH2）对MG-63细胞增殖的影响Fig.2　The effects of bone collagen hydrolysates（BCH）with various concentrations on cell growth in MG-63 cells

2.4对细胞ALP活性的影响

在成骨细胞分化时胞浆内有丰富的ALP，ALP分泌到胞外是细胞外基质成熟的标志之一，该酶对后续的钙化过程有着重要作用，可以降解钙化抑制因子并促进基质释放磷酸根离子，增加局部钙离子及磷酸根离子的浓度以促进钙化结晶的形成，因此常被用来作为成骨细胞分化的标志［14-15］。由图3可知，培养96 h时BCH1与BCH2均能显著（p＜0.05）提高ALP的活性，且胶原肽对细胞ALP活性的促进作用呈时间依赖性。

图3　胶原肽（BCH1、BCH2）对MG-63细胞ALP活性的影响Fig.3　The effects of bone collagen hydrolysates（BCH）on ALP activity in MG-63 cells

2.5对细胞BMP-2 mRNA表达的影响

骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）是TGF-β超家族成员，是一族分子量约为30～38 ku的二聚体，是促进成骨细胞增殖、分化的关键细胞蛋白因子。其中，BMP-2通过促进成骨细胞转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）的产生来刺激成骨细胞的分化，以促进碱性磷酸酶等基因的表达［16-17］，在极短时间内即能引发成骨细胞的分化并抑制其凋亡［18-19］。如图4所示，BCH两个组分均能上调BMP-2因子mRNA的表达水平。与对照组相比，在200 μg/mL浓度下，BCH1、BCH2处理组分别上调了22.13%和19.98%（p＜0.01）。结果表明鳕鱼骨胶原肽能够有效提高细胞因子BMP-2 mRNA的表达，进而促进成骨细胞的分化。

图4　不同浓度胶原肽（BCH1、BCH2）对MG-63细胞BMP-2 mRNA表达水平的影响Fig.4　The effects of bone collagen hydrolysates（BCH1，BCH2）with various concentrations on mRNA expression of BMP-2 in MG-63 cells

2.6对细胞OPG与RANKL mRNA表达的影响

骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）属于可溶性假受体，它能够竞争性结合核因子-κB受体活化因子配基（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）以阻断骨吸收信号的传递［20-21］。RANKL能够与破骨细胞表面信号受体核因子-κB受体活化因子（Receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）作用，是破骨细胞存活及其最终形成多核细胞并进行骨吸收的关键因子［22-23］。如图5所示，100 μg/mL的BCH2，200 μg/mL的BCH1与BCH2处理组能够极显著促进MG-63细胞的OPG因子mRNA表达水平（p＜0.01），且具有一定的剂量-效应关系；BCH两个组分同时能够抑制RANKL的mRNA表达水平（p＜0.01）。

图5　不同浓度胶原肽（BCH1、BCH2）对MG-63细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响Fig.5　The effects of bone collagen hydrolysates（BCH1，BCH2）with various concentrations on mRNA expression of OPG and RANKL in MG-63 cells

OPG/RANKL/RANK系统是成骨细胞作用于破骨细胞的重要途径，可作为抗骨吸收活性物质作用的标靶。实验结果显示鳕鱼骨胶原肽可通过调节成骨细胞OPG与RANKL的mRNA表达水平以间接对破骨细胞的增殖分化进行调控，进而从该角度解释了胶原肽改善骨代谢的机理。

3　结论

本实验以人成骨样MG-63细胞为体外模型，初步探讨了不同分子量组分鳕鱼骨胶原肽（BCH1、BCH2）对MG-63细胞的作用效果。实验结果表明鳕鱼骨胶原肽对MG-63细胞无明显细胞毒副作用，具有较好的安全性。在培养96 h时样品可有效提高细胞ALP的活性。鳕鱼骨胶原肽能够上调细胞BMP-2、OPG的表达水平，同时抑制RANKL的表达（p＜0.01），这表明胶原肽能够在转录水平上提高成骨细胞BMP-2蛋白因子的表达，同时通过提高成骨细胞OPG/RANKL的相对表达量以间接对破骨细胞的成熟及活化进行调控。在骨质疏松的预防和治疗研究中，寻找副作用小、在促进骨形成的同时能够抑制骨吸收的生物活性物质已经成为重要的研究方向。鳕鱼骨胶原肽具有以上特点，因此可作为潜在的抗骨质疏松活性肽进行进一步开发利用。

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Preparation of cod bone collagen hydrolysates and its osteogenic effect on MG-63 cells

WANG Shan-shan1，2，ZHANG Zhao-hui1，ZHAO Xue1，HOU Hu1，LI Ba-fang1，*
（1.Collagen of Food Science and Technology，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China）

The cod bone collagen hydrolysates were prepared by commercial protease.Utilizing cultured MG-63 cells，the osteogenic effect of collagen hydrolysates with different molecular weights was studied in vitro. Compositional analyses and histological observation was performed.Cod bone collagen hydrolysates with different molecular weights were obtained.The cultured MG-63 cells were used to investigate the osteogenic effect by detecting the ALP activity and the mRNA expression of Bone morphogenetic protein（BMP-2），Osteoprotegerin（OPG）and Receptor activator of nuclear factor-κB ligand（RANKL.The proximate analysis of fish bone exhibited that protein content in bone reached 14.5%.Large amounts of collagen fibrils in fish bone were observed using Van Gieson staining technology.Cod bone collagen hydrolysates could increase the ALP activity and BMP-2 mRNA expression level，meanwhile remarkably increase the ratio of OPG/RANKL mRNA expression in order to indirectly influence the osteoclast differentiation and maturation.Cod bone was a good collagen resource，the collagen hydrolysates extracted from cod bone exhibited osteogenic effect and could be used as a natural anti-osteoporotic supplement.

cod bone；collagen hydrolysates；enzymatic hydrolysis；osteoblast

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0095-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.011

2015－01－22

王珊珊（1984-），女，博士，研究方向：海洋生物活性物质，E-mail：wsstougao@126.com。

李八方（1953-），男，博士，教授，研究方向：海洋生物活性物质、功能食品与制品，E-mail：bfli@ouc.edu.cn。

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2014AA093508）；国家自然科学基金项目（31471606）；青岛市博士后研究人员应用研究项目。