醋酸甲羟孕酮和复方庚酸炔诺酮对BALB/c小鼠下生殖道感染沙眼衣原体敏感性的影响

韩燕 郑冰洁 尹跃平 钟铭英 于瑞星

醋酸甲羟孕酮和复方庚酸炔诺酮对BALB/c小鼠下生殖道感染沙眼衣原体敏感性的影响

韩燕 郑冰洁 尹跃平 钟铭英 于瑞星

目的 比较醋酸甲羟孕酮和复方庚酸炔诺酮对小鼠下生殖道感染沙眼衣原体敏感性的影响。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机分为6组，分别为空白对照组、醋酸甲羟孕酮对照组、复方庚酸炔诺酮对照组、无性激素处理感染组、醋酸甲羟孕酮感染组、复方庚酸炔诺酮感染组。其中，空白对照组、醋酸甲羟孕酮对照组和复方庚酸炔诺酮对照组小鼠在接受相应的激素单次处理后第5天通过阴道接种MyCoy细胞悬液；无性激素处理感染组、醋酸甲羟孕酮处理感染组和复方庚酸炔诺酮处理感染组小鼠在接受相应的激素单次处理后第5天通过阴道感染接种含1×107E型沙眼衣原体包涵体形成单位（ifu）的悬液。接种后第4、7、14天，采集小鼠的阴道冲洗液进行细胞培养，并在每个时间点每组随机选取3只小鼠处死，取阴道、子宫标本固定，HE染色镜检。采用χ2检验比较不同组别的感染率。结果 接种后对照组均无沙眼衣原体生长，无性激素处理感染组和复方庚酸炔诺酮感染组在接种沙眼衣原体后第4天培养阳性率均为1/10，第7天和14天均无沙眼衣原体生长；醋酸甲羟孕酮感染组在接种后第4天培养阳性率为7/10，第7天为2/7，第14天无沙眼衣原体生长。Fisher精确概率计算显示，醋酸甲羟孕酮感染组接种后，第4天感染率高于无性激素处理组和复方庚酸炔诺酮感染组（P=0.03）；而第7天醋酸甲羟孕酮感染组感染率与其他两个组差异无统计学意义（P=0.23）。醋酸甲羟孕酮处理的两组在接种后第4天、第7天和第14天阴道内黏液增多，阴道复层鳞状上皮变薄，上皮细胞黏液化，管腔有分泌物，黏膜下层少量炎症细胞浸润，接种沙眼衣原体后第4天阴道发生病理变化，即管腔出现大量炎性分泌物，组织轻度水肿，黏膜下层少量炎症细胞浸润。复方庚酸炔诺酮处理的两组在各时间点阴道表现均正常，而子宫在接种后7 d，出现组织轻度水肿，腺腔扩张，分泌物潴留，散在炎细胞浸润。结论 小鼠经醋酸甲羟孕酮处理后动情周期固定在动情间期，阴道上皮黏液化，可能有助于增加小鼠沙眼衣原体在阴道内感染的敏感性。经复方庚酸炔诺酮处理后小鼠动情期没有明显改变，子宫有改变，而这不能改变沙眼衣原体在阴道内感染的敏感性。

醋酸甲羟孕酮；炔诺酮；沙眼衣原体；疾病模型，动物；小鼠；生殖道感染

沙眼衣原体感染生殖道上皮细胞后，可以诱导组织损伤，如果患者得不到及时的诊断和治疗会导致持续的传播并引起严重的并发症和后遗症。构建动物感染模型是了解沙眼衣原体感染致病机制、免疫、病理、进展过程以及观察药物疗效和毒性等的重要手段。沙眼衣原体在灵长类、豚鼠、猪、小鼠等动物的生殖器官均能引起感染。小鼠是常用的动物模型，但研究显示小鼠生殖道感染后的表现与人生殖道感染后的表现不同，很少引起系统性病变，炎症较轻，且很快会被清除。孕激素处理能够增加小鼠阴道对沙眼衣原体的易感性，模拟人感染的自然进程。为了解不同孕激素对小鼠感染沙眼衣原体敏感性的影响，我们选取复方庚酸炔诺酮和醋酸甲羟孕酮两种激素，观察并比较这两种激素处理后小鼠下生殖道感染沙眼衣原体的情况。

材料与方法

一、材料

6周龄雌性SPF级BALB/c小鼠产自扬州大学动物中心［SCXK（苏）2012-0004］，体重（21.47±1.30）g，于中国医学科学院皮肤病研究所实验动物中心按要求喂养。小鼠笼具为独立送风隔离笼具，换气次数为每小时30次，进风风速为30 m/h；温度为（22±2）℃，相对湿度为（30±5）%。饲料为经60Co辐照灭菌后的SPF级小鼠维持粮，产自江苏省协同医药生物工程有限责任公司［苏饲审（2008-01.0080）］，每日每笼投喂约50 g。饮用水为灭菌水，每日每笼约200 ml。E型沙眼衣原体Bour标准株来自美国标准生物品收藏中心（American type culture collection,ATCC），本实验室保存传代。醋酸甲羟孕酮注射液（150 mg/ml，批号X06089）产自美国辉瑞制药有限公司。复方庚酸炔诺酮注射液（每ml含庚酸炔诺酮 50 mg，戊酸雌二醇 5 mg，批号：110401）产自浙江仙琚制药有限公司。

二、方法

1.E型沙眼衣原体株体外培养、制备感染液：用E型沙眼衣原体株感染MyCoy细胞，在含有10%胎牛血清的1640培养液中培养，收集单层感染McCoy细胞，经传代使McCoy细胞被感染率达到90%，收集细胞保存在蔗糖谷氨酸磷酸盐缓冲液中，定量后-70℃保存备用。

2.小鼠喂养及接种：60只6周龄的雌性BALB/c小鼠［1］称重后随机分为6组，分别为空白对照组、醋酸甲羟孕酮对照组、复方庚酸炔诺酮对照组、无性激素处理感染组、醋酸甲羟孕酮感染组、复方庚酸炔诺酮感染组。实验前使用细胞培养的方法对每只小鼠的阴道冲洗液进行沙眼衣原体检测，确证每只小鼠实验前不携带沙眼衣原体。各组小鼠在标准条件下适应环境喂养1周后，在醋酸甲羟孕酮对照组及感染组，单侧大腿外侧肌内注射醋酸甲羟孕酮注射液（150 g/L）20 μl［2-3］；在复方庚酸炔诺酮对照组及感染组，单侧大腿外侧肌内注射复方庚酸炔诺酮注射液20 μl。激素单次处理5 d后使用移液器吸取20 μl浓度约为 1 × 108包涵体形成单位（ifu）/ml的E型沙眼衣原体株接种至相应各组小鼠的阴道内（深入阴道0.5 cm），接种后仰卧静止1 min。对照组接种MyCoy细胞悬液。

3.小鼠大体情况观察：接种后第4、7、14天测量小鼠体重并记录，同时观察小鼠活动情况、外生殖道表现及外阴分泌物情况等并拍照记录。

4.细胞培养及病理检测小鼠生殖道沙眼衣原体：接种后第4、7、14天，用 RPMI1640 运送液 100μl，每次吸取20 μl深入小鼠阴道0.5 cm处，停留30 s后回收冲洗液，反复3次，得到约100 μl阴道冲洗液。采集得到的阴道冲洗液标本50 μl用于细胞培养检测，50 μl用于盲传，每次检测均设衣原体阳性对照和阴性对照。每一玻片见到≥1个包涵体为阳性［4］；第1次检测阴性的标本将利用盲传保存液再检测和盲传，共3次。3次盲传后检测仍为阴性的标本则认定为真正的阴性标本。组织形态学观察：接种后第4、7、14天，各组随机取3只小鼠，收集阴道冲洗液后颈椎脱臼处死，解剖取阴道、子宫标本，4%甲醛液固定后，常规石蜡包埋切片，HE染色镜检。

5.统计学方法：使用EXCEL2013录入数据，用IBM SPSS Statistics 20进行数据整理、转换和分析。采用χ2检验比较不同组别的感染率，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、沙眼衣原体培养的结果

在各个时间点采集的阴道冲洗液标本中，空白对照组、醋酸甲羟孕酮对照组、复方庚酸炔诺酮对照组培养的结果均为阴性。Fisher精确概率计算显示醋酸甲羟孕酮处理组4 d后的感染率（7/10，95%CI：35.4%～91.9%）高于无性激素处理组和复方庚酸炔诺酮处理组（均为1/10，95%CI0.5%～45.9%，P=0.03）；而7 d后感染率醋酸甲羟孕酮处理组（2/7，95%CI5.6%～69.7%）与其他两个组（均为 0，95%CI0～43.9%），差异无统计学意义（P=0.23。14 d后所有组别均未感染沙眼衣原体。

二、小鼠接种沙眼衣原体后器官大体形态及组织病理表现

大体形态：空白对照组及无性激素处理感染组各时间点外阴、阴道内黏液、解剖后子宫阴道均无异常。醋酸甲羟孕酮对照组及感染组在各时间点外阴、解剖后对照组阴道均无异常，但阴道内黏液很多。复方庚酸炔诺酮对照组及感染组在各时间点外阴、阴道内黏液、子宫阴道均无异常。组织病理表现：小鼠接种沙眼衣原体后第4天，第7天和第14天后醋酸甲羟孕酮对照组阴道均出现复层鳞状上皮变薄、上皮细胞黏液化、管腔有分泌物、黏膜下层少量炎症细胞浸润的表现，子宫腺腔正常，内膜轻度水肿，散在少量炎症细胞浸润；醋酸甲羟孕酮感染组第4天阴道出现复层鳞状上皮变薄，上皮细胞黏液化，管腔有大量炎性分泌物，黏膜下层少量炎症细胞浸润，子宫内膜水肿，炎症细胞浸润（图1），而至第7天和第14天小鼠阴道病理改变和醋酸甲羟孕酮对照组基本相同。复方庚酸炔诺酮感染组和对照组在接种后的第4天，第7天和第14天的阴道表现均正常，而在沙眼衣原体感染后第7天（即注射激素后第12天）子宫组织轻度水肿，腺腔扩张，分泌物潴留，散在炎症细胞浸润（图2）。

图1 醋酸甲羟孕酮感染组小鼠接种沙眼衣原体后第4天组织学表现（HE×200） 1A：阴道：复层鳞状上皮变薄，上皮细胞黏液化，管腔有分泌物，黏膜下层少量炎症细胞浸润；1B：子宫：腺腔正常，内膜轻度水肿，散在少量炎症细胞浸润

图2 复方庚酸炔诺酮感染组小鼠接种沙眼衣原体后第7天组织学表现（HE×200） 2A：子宫腺腔扩张，分泌物潴留，黏膜下层伴有少量的炎症细胞浸润；2B：子宫组织轻度水肿，腺腔扩张，分泌物潴留，散在炎症细胞浸润

讨 论

雌性小鼠性成熟后，生殖器官发生增生、退化的周期性变化为动情周期。一般分为四期：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。动情前期阴道复层鳞状上皮细胞增厚但角化未完全；动情期阴道复层鳞状上皮细胞厚且角化完全，表面的上皮细胞脱落至管腔中；动情后期表现为复层鳞状上皮细胞退化，角化完全的细胞脱落，同时间质内出现白细胞并浸润表皮；动情间期阴道的上皮细胞变薄且黏液化，间质内出现很多白细胞并通过表皮移入直至管腔。鼠的一个动情周期为4～5 d，可通过阴道脱落细胞的变化了解动情周期的全部过程［5］。实验中各对照组及复方庚酸炔诺酮感染组在不同时间点可以观察到不完全相同的动情周期的病理改变；而醋酸甲羟孕酮感染组小鼠动情周期一直维持在动情间期：复层鳞状上皮变薄，上皮细胞黏液化，管腔有分泌物，黏膜下层少量炎症细胞浸润。Tuffrey等［6］在1981年即发现孕激素是建立小鼠生殖道感染沙眼衣原体模型的关键因素。后续的动物研究已发现，孕酮预处理后可以增加小鼠对沙眼衣原体感染的易感性［7-8］，推测是在孕激素的影响下，小鼠生殖道上皮细胞层变薄并能够稳定地处在动情间期的环境下，允许建立感染。而我们观察到醋酸甲羟孕酮感染组小鼠阴道上皮的改变证实了该假说。由于本实验中每次采集的阴道冲洗液量不足以进行细胞因子的分析，故此假说尚待进一步验证。而人群研究的结果同样也显示醋酸甲羟孕酮能够增加人感染沙眼衣原体的风险［9］。

醋酸甲羟孕酮感染组接种沙眼衣原体后第4天小鼠阴道腔出现大量的炎症分泌物，组织轻度水肿疏松，黏膜下层少量炎症细胞浸润，而阴道冲洗液的细胞培养结果基本为阳性，但在接种后第7天小鼠阴道炎性分泌物明显减少，而阴道冲洗液的细胞培养结果基本为阴性，冲洗液细胞培养结果与病理切片观察结果之间具有较好的相关性，均提示沙眼衣原体感染为急性感染［10］，主要表现为阴道炎，而子宫和子宫颈没有严重的炎症改变，且在解剖时未发现卵巢有所改变，因此未对小鼠的卵巢进行进一步作病理分析。未经处理小鼠的动情后期及动情间期也会有炎症细胞浸润，因此研究者在进行沙眼衣原体动物模型建立时需要考虑到动情周期对病理表现的影响。我们观察各时间点各小鼠的大体改变时未发现以往研究中所出现的特殊表现如，小鼠外阴红肿，毛发脱落、灰暗无光泽等［3，11］，可能尚须进一步的实验证实。

复方庚酸炔诺酮作为健康育龄妇女的避孕药［12］，主要含有庚酸炔诺酮和戊酸雌二醇［13］，为雌激素及孕激素类避孕药，系通过抑制垂体促性腺激素分泌而抑制排卵，达到避孕作用。本研究所用的复方庚酸炔诺酮含庚酸炔诺酮50 mg、戊酸雌二醇5 mg，避孕有效率达 99．8%［14］。虽然其中的炔诺酮是孕激素，但是由于雌激素的存在，小鼠的动情周期没有出现孕激素影响的主要病理表现，复方激素对小鼠感染沙眼衣原体的敏感性没有改变。这也从另一个侧面验证了小鼠动情间期生殖道上皮改变对增加小鼠对沙眼衣原体感染敏感性的重要性。

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Effects of medroxyprogesterone acetate and compound norethisterone enanthate on the susceptibility of BABL/c mice to lower reproductive tract infection with

Chlamydia trachomatisHan Yan,Zheng Bingjie,Yin Yueping,Zhong Mingying,Yu Ruixing.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;National Center for Sexually Transmitted Disease Control,China Center for Disease Control and Prevention,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo compare the effects of medroxyprogesterone acetate （MPA）and compound norethisterone enanthate （CNE）on the susceptibility of BABL/c mice to lower reproductive tract infection withchlamydia trachomatis（Ct）.MethodsA total of 60 BALB/c mice were randomly and equally divided into 6 groups:MPA-pretreated control group and CNE-pretreated control group inoculated with MyCoy cell suspensions in the vagina on the 5th day after single treatment with MPA and CNE respectively,blank control group receiving no treatment,MPA-pretreated infected group and CNE-pretreated infected group inoculated with 1 × 107inclusion-forming units（IFU）of Ct serovar E in the vagina on the 5th day after single treatment with MPA and CNE respectively,control infected group inoculated with the same quantity of IFU of Ct serovar E in the vagina but receiving no pretreatment.On day 4,7 and 14 after inoculation,vaginal irrigation fluid was obtained from all the mice for cell culture of Ct.Three mice were randomly selected from each of these groups at the above three time points and sacrificed,and vaginal and uterine tissue specimens were obtained for hematoxylin-eosin（HE）staining and microscopic examination.Chi-square test and Fisher's exact test were conducted to compare infection rate among different groups.ResultsNo growth of Ct was observed in the three control groups at the above time points.The culture-positive rate of Ct was 1/10 on day 4 but 0 on day 7 and 14 in boththe CNE-pretreated infected group and control infected group,7/10 on day 4,2/7 on day 7 but 0 on day 14 in the MPA-pretreated infected group.Fisher's exact test revealed that the culture-positive rate of Ct was significantly higher in the MPA-pretreated infected group than in the control infected group and CNE-pretreated infected group on day 4（bothP=0.03）,but similar among the three infected groups on day 7 （P=0.23）.Both the MPA-pretreated control group and infected group showed an increase in endovaginal mucus,thinning of vaginal stratified squamous epithelium,mucification of vaginal epithelium,presence of secretions in vaginal lumen and submucosal infiltration of a few inflammatory cells on day 4,7 and 14,as well as appearance of pathological changes（including the presence of large quantities of purulent secretions in lumen,mild tissue edema and submucosal infiltration of a few inflammatory cells）in the vagina on day 4.Vaginal tissues were normal in both the CNE-pretreated infected group and control group at the above three time points,but mild tissue edema,lumen expansion,secretion retention and infiltration of scattered inflammatory cells were observed in the uterus on day 4 after inoculation.Conclusions MPA can arrest the estrous cycle of mice at diestrus with the mucification of vaginal epithelium,which may increase the susceptibility to Ct vaginal infection in mice.In contrast,CNE has no obvious effect on the estrous cycle and susceptibility to Ct vaginal infection despite of the appearance of pathological changes in the uterus.

Medroxyprogesterone acetate;Norethindrone;Chlamydia trachomatis;Disease models,animal;Mice;Reproductive tract infections

Yin Yueping,Email:yinyp@ncstdlc.org

作者单位：210042南京，中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，中国疾病预防控制中心性病控制中心

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.005

国家十二五“重大新药创制”科技重大专项课题（2012ZX09301002005）；协和青年基金（33320140135）

尹跃平，Email：yinyp@ncstdlc.org

2014-04-24）

（本文编辑：尚淑贤）