高脂饮食对小鼠皮肤创面修复影响的实验研究

曹玮 陈蕾 吴毅平 冯幼平 黄立

·论著·

高脂饮食对小鼠皮肤创面修复影响的实验研究

曹玮 陈蕾 吴毅平 冯幼平 黄立

目的 观察长期高脂饮食对小鼠皮肤创面愈合的影响并初步探讨其相关机制。方法 10周龄C57BL/6J野生型小鼠16只，随机分为2组，每组8只，分别采用高脂及普通膳食喂养8周后，在小鼠背部建立全层皮肤缺损模型。每日对创面愈合状况进行观察，记录创面愈合率及上皮化水平。于术后第14天处死所有小鼠并切取创面组织进行组织学检测，比较两组创面新生表皮厚度、创面床内胶原沉积率、新生血管数目、细胞增殖及炎症细胞浸润水平。喂养前、喂养8周后及手术后第14天检测体重。术后第14天禁食12 h后检测外周血总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平。采用t检验进行统计学分析。结果 高脂膳食组在高脂喂养8周后及手术后第14天平均体重［分别为（27.3±0.7）g和（28.8±0.7）g］显著高于普通膳食组［分别为（21.2±0.6）g和（23.1±1.1）g］，两组比较，t值分别为21.98和25.22，均P＜0.001。术后第14天，高脂膳食组TG及TC水平［分别为（1.35±0.32）mmol/L和（4.21±0.41）mmol/L］远高于普通膳食组［分别为（0.99±0.28）mmol/L和（2.71±0.31）mmol/L,两组比较，t值分别为2.24和6.49，均P＜0.05］；高脂膳食组创面愈合时间明显慢于普通膳食组［分别为（13.5±0.5）d和（12.6±1.1）d，t=1.99，P＜0.05］，创面新生表皮薄于普通膳食组［分别为（47.8±13.8）μm 和（95.7±13.7）μm，t=5.68，P＜0.001］，CD31阳性血管数低于普通膳食组［分别为（8±1）个和（13±3）个，t=4.1，P＜0.001］，ki-67阳性细胞数目低于普通膳食组［分别为（21±4）个和（49±10）个，t=3.33，P＜0.001］，但巨噬细胞及肥大细胞浸润水平明显高于普通膳食组（均P＜0.05），各组创面床内胶原沉积率差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 长期高脂饮食会影响小鼠创面的愈合，延缓皮肤创面修复。

膳食，高脂；伤口愈合；疾病模型，动物；胶原；肥大细胞；巨噬细胞；血管

皮肤创面的修复是从皮肤受到外伤开始到瘢痕形成而结束的一个复杂的生理过程，分为出血期、炎症期、增生期及塑形期［1］。在愈合过程中，以上皮化、局部血管化、细胞迁移、胶原合成沉积为特征的增生性修复为创面提供新鲜的肉芽组织；同时创面边缘受到牵拉收缩使创面变小。多种细胞及细胞因子参与此过程［2］，全身或局部微环境的改变均会干扰创伤的正常愈合［3］。高脂饮食会影响脂肪组织对外科手术或创伤的应答［4］，增加手术并发症发生的概率。据报道，长期高脂饮食的患者行植皮手术的并发症要远远高于普通人群，其手术的效果也显著低于正常人群［5］。本研究建立高脂饮食喂养小鼠背部创面缺损模型，观察并比较高脂饮食小鼠和普通膳食喂养小鼠背部创面愈合过程，从而明确高脂饮食对创面愈合的具体影响，探讨其可能的机制。

材料与方法

一、实验动物及饮食喂养

健康雄性10周龄C57BL/6J小鼠16只（美国Jackson实验室提供），随机分为普通膳食组及高脂膳食组，每组8只。普通膳食组给予基础饲料；高脂膳食组给予高脂饲料，高脂饲料配方参考文献［6］，其脂肪含量42%，碳水化合物43%，蛋白质15%；两组小鼠喂养8周［7］后立即行创面手术，手术后高脂膳食组继续高脂饮食。喂养前、喂养8周后及手术2周后测量体重。

二、小鼠背部创面模型建立

小鼠吸入异氟醚全身麻醉，剃除背部毛发及消毒后，用皮肤钻孔器（美国Miltex公司，AC61509-5000）在小鼠背面双侧肩胛下角间制造直径8 mm的皮肤全层缺损创面；完全止血后，即刻使用Tegderm封闭膜（美国3M公司，PP2501）覆盖创面。术后每日更换封闭膜，第4天去除封闭膜，创面裸露保持干燥。术后在动物中心统一分笼饲养，每日测量体重并记录。

三、创面观察

术后第2天起开始测量创面。采用透明膜面积称重法记录创面大小，并按（1-现创面面积/原创面面积）×100%计算每日创面闭合率；每日在同等光照条件下进行创面拍照监测。

四、血清指标检测

术后第14天禁食12 h后经眼球取外周血，离心得血清，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测外周血总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）。所用试剂盒产自南京森贝伽生物科技有限公司。

五、创面组织学检测

术后第14天小鼠创面均完全闭合后，切取创面新生组织及创周约5 mm正常皮肤，4%甲醛固定，石蜡包埋后切片（5 μm厚）、脱蜡，部分切片按试剂盒指示步骤行HE染色及Masson三色染色（美国Sigma-aldrich公司）。部分切片行甲苯胺蓝染色。部分切片置3%过氧化氢溶液内于室温下孵育10 min，Tris缓冲液（TBST）洗片后以10mmol/L枸橼酸在98℃下20 min热修复，TBST冲洗，10%山羊血清（美国Vector Laboratories公司）封闭1 h，滴加相应的一抗工作液染色，以抗体稀释液代替一抗作为阴性对照，室温下孵育1 h。一抗工作液包括：兔抗Ki67单克隆抗体（稀释比例1∶400，美国Thermo Scientific公司）、兔抗CD31多克隆抗体（1∶200，美国Abcan公司）、鼠抗F4/80单克隆抗体（1∶1 500，美国eBioscience公司）。TBST洗片，加入相应的生物素标记的二抗工作液孵化。二抗工作液包括：羊抗兔IgG（1∶200，美国Vector Laboratories公司）、羊抗鼠IgG（1∶200，美国Vector Laboratories公司）。室温下孵化30 min后继续以亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）免疫组化试剂（美国Vector Laboratories公司）复合物孵化30 min，DAB染色（丹麦Dako公司），苏木紫复染。所有玻片染色后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

染色结果在同等条件下拍照。使用NIH ImageJ软件测量创面新生表皮厚度；观察5个视野进行细胞计数求均值分析细胞增殖、创面局部血管新生及巨噬细胞、肥大细胞浸润情况；参考文献［8］计算胶原沉积率。

六、统计学分析

结 果

一、小鼠体重及血脂比较

见表1。分组喂养前，两组平均体重无明显差异；分组喂养8周后，高脂膳食组平均体重显著高于普通膳食组；创面愈合后，两组平均体重仍存在显著差异。在术后第14天，高脂膳食组TG和TC均远高于普通膳食组，差异均有统计学意义。

二、小鼠创面愈合比较

高脂膳食组创面开始收缩及上皮化出现时间、创面完全愈合时间均晚于普通膳食组（t值分别为2.37、1.62、1.99，均P ＜ 0.05）。见图 1。术后每天普通膳食组创面愈合率均低于高脂膳食组，其中术后第5天（t=1.49）、第 7～8天（t值分别为 1.84，2.34）、第 10 ～ 14 天 （t值分别为 3.31、1.94、2.84、1.84、2.18）两组闭合率差异有统计学意义（均P＜0.05）。见图2。

三、小鼠创面组织学结果比较

1.新生表皮的比较：HE染色，两组均可见完整的新生表皮（图3）。高脂膳食组新生表皮厚度［（47.8±13.8）μm］远低于普通膳食组［（95.7±13.7）μm，P＜0.001］。

2.胶原沉积率比较：从图4可见，术后14 d，两组创面床中均可见大量蓝色的胶原蛋白沉积。普通膳食组胶原沉积率（0.54±0.04）与高脂膳食组（0.53±0.01）比较，差异无统计学意义（t=0.75，P ＞0.05）。

3.炎症细胞浸润比较：F4/80染色可见大量胞质染为红褐色的巨噬细胞浸润（图5）。高脂膳食组每高倍视野（×400）下创面床中巨噬细胞浸润数目（55±4）高于普通膳食组（43±4，t=4.12，P＜0.05）。

甲苯胺蓝染色示散在分布的蓝色肥大细胞（图6）。每高倍视野（×200）下肥大细胞浸润数目高脂膳食组（15±4）高于普通膳食组（3±1，t=5.21，P ＜ 0.05）。

表1 高脂膳食组与普通膳食组小鼠体重及血脂浓度对比（x±s）

图1 两组小鼠创面收缩出现时间、上皮化出现时间及完全愈合时间比较 所有数据为± s；n=8；两组比较，均 P＜0.05

图2 两组小鼠术后每天创面愈合率比较 所有数据为± s；n=8；a：两组比较，P ＜ 0.05

4.新生血管水平比较：CD31免疫组化染色显示，两组创面组织内均可见褐色阳性血管（图7）。每高倍镜视野（×400）下阳性血管数高脂膳食组为（8±1）个，普通膳食组为（13±3）个，两组差异有统计学意义（t=4.1，P＜0.001）。

5.细胞增殖水平的比较：两组小鼠Ki67染色可见大量黄褐色染色的阳性细胞分布（图8）。高脂膳食组每高倍视野下（×400）创面床中Ki67阳性细胞数平均为21±4，普通膳食组为49±10，两组差异有统计学意义（t=3.33，P＜0.001）。

讨 论

长期高脂饮食会导致肥胖及血脂升高。在本研究中，我们参考文献［6-7］报道的高脂饮食喂养方法建模，喂养8周后，高脂膳食组平均体重远超普通膳食组；在皮肤造创手术后2周，高脂膳食组体重仍较普通膳食组增长约24.5%。除超重外，高脂膳食组外周血TG、TC水平分别较普通膳食组升高约36.4%和55.4%，处于代谢紊乱状态。

高脂饮食导致血脂升高和肥胖，二者均是创伤愈合的重要不利因素［2］。术前进行短期的饮食结构控制可以提高机体对创伤的急性应激性［9］，对创伤愈合具有促进作用。但二者的具体作用机制目前尚未明确［10］。Nascimento 和 Costa［11］观察肥胖大鼠背部创面愈合过程发现，背部创面在术后14 d时比正常大鼠大19%，术后21 d时大21%；同时，他们还观察到直至创伤后21 d，肥胖大鼠背部创面上皮化程度比正常大鼠低11%。而肥胖Zucker大鼠背部创伤术后28 d，其创面明显大于对照组，创缘的张力远远低于对照组［10］。我们在实验中也观察到，高脂膳食组创面愈合速度减慢，上皮化出现时间推迟，创面完全愈合时间延长，这一结果与以上报道相符合。

图3 小鼠新生上皮厚度比较（HE×400） 创面床中高脂膳食组小鼠新生表皮厚度小于普通膳食组（箭头所示为新生上皮）

图4 小鼠胶原沉积比较（Masson三色染色×200） 两组小鼠术后14 d创面床中胶原沉积无明显差别

图5 小鼠巨噬细胞密度比较（F4/80染色×400） 高脂膳食组创面床中的巨噬细胞密度明显高于普通膳食组（箭头所指的形状不规则的细胞为红褐色的巨噬细胞）

图6 小鼠肥大细胞数目比较（甲苯胺蓝染色×200） 高脂膳食组肥大细胞浸润数目较普通膳食组多（箭头所指为蓝色的肥大细胞）

图7 小鼠新生血管数目比较（CD31染色×400） 普通膳食组创面新生血管数目多于高脂膳食组（箭头所指为CD31阳性新生血管）

图8 小鼠细胞增殖水平比较（Ki67染色×400） 高脂膳食组创面增殖细胞数目明显低于普通膳食组（箭头示Ki67染色阳性的增殖细胞）。图4A~9A均为高脂膳食组，4B~9B均为普通膳食组

研究认为，脂肪组织不仅是机体最大的能量库，还具有内分泌功能，能分泌多种前炎症细胞因子和炎症细胞趋化因子；同时，体内过高的血脂还会激活一种恒定的自然杀伤T细胞（invariant natural killer t cell,iNKT），激活的iNKT会引起多种前炎症细胞因子水平不断增高［12］。这些升高的炎症生物因子对免疫应答及炎症反应均有促进作用，并可延长炎症反应的持续时间。研究显示，脂肪堆积可以持续诱发低水平的慢性炎症反应［13］。在创伤愈合过程中，长期低水平的炎症反应会延缓创伤的愈合时间，严重时会造成创面迁延不愈。国外研究报道如果巨噬细胞状态在创伤愈合过程中发生改变，异常的创伤愈合将会发生，如延迟愈合、增生性瘢痕形成等［14］。我们研究发现，高脂膳食组创面床中巨噬细胞和肥大细胞数目均显著多于普通膳食组，提示前者炎症反应水平存在异常，而这可能是其创面愈合延迟的重要原因。

创面床中新生表皮的厚度、细胞增殖水平及局部血管化程度均可以反映创面的增殖情况。在创伤愈合过程中，以巨噬细胞为主的炎症细胞可清除细胞及坏死组织碎片，还可分泌如血管内皮生长因子、转化生长因子β1等调控成纤维细胞和内皮细胞的增生转化及迁移，对增生及组织塑形期中细胞外基质合成、胶原沉积和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化起重要作用。在高脂膳食组背部创面床中，炎症细胞过度活化，数量异常增多，这些变化将会影响创面的正常愈合，抑制创面的增殖修复。如本研究结果所示，虽然两组在创面内胶原沉积程度上无明显差异，但高脂膳食组创面内新生表皮厚度、细胞增殖水平、血管新生程度明显低于普通膳食组。这些结果也和以往报道相符［15-16］。

总之，本研究通过动物实验证明，在创面愈合过程中，高脂饮食不仅会影响创面的收缩，还可通过抑制创面上皮化、细胞增殖及血管新生延缓皮肤创面修复。而这种情况可能是由高脂饮食引起的机体代谢及脂肪旁分泌紊乱、巨噬细胞及肥大细胞的过度浸润和激活引起的炎症反应失调所致。但是，当前的发现是建立在小鼠模型之上的，由于人类和小鼠皮肤构造及创伤愈合机制方面的差异，该结果还需进一步验证；同时，高脂饮食发挥影响的具体机制亦需要更深入的研究。

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复方甘草酸苷胶囊（甘乐）征文通知

皮炎湿疹与荨麻疹是皮肤科常见病，病情常反复，复方甘草酸苷胶囊（甘乐）是治疗该类皮肤病的有效药物之一。为了更好地发挥甘乐在皮肤病治疗中的作用，中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会与北京凯因科技股份有限公司共同开展2015年度凯因甘乐有奖征文活动，欢迎各级皮肤科医师积极参与。

征文范围：不同剂量复方甘草酸苷胶囊治疗皮炎湿疹疗效观察；复方甘草酸苷治疗急性荨麻疹疗效观察。

活动内容：本次征文活动将在2016年中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会年会上进行评比。前3名将分别获得3万元、2万元、1万元临床研究基金并颁发中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会环境与职业性皮肤病学组研究基金及获奖证书；优秀奖4名，获得5 000元奖励；入围奖10名，获得1 000元奖励。参加者请将论文电子版发至电子邮箱annlingchen@126.com，并注明“学会征文”。

论文提交截止日期：2015年12月30日。

北京凯因科技股份有限公司对本次活动拥有最终解释权。

皮肤美容化妆品制剂研修班通知及共建掌上皮肤科

①举办全国皮肤美容化妆品制剂研修班，皮肤、美容外用制剂及化妆品制备的教学及实习（2015年10月27-31日，苏州）；授课教授：王玉玺、艾儒棣、邓丙戌、王伯亚、张宝元、马振友；②供应皮肤美容外用制剂原料，有求必复；③转让马振友发明的生发和养发外用药国家专利（201210387061.9）；④陈洪铎、廖万清、张学军策划，马振友、张建中、郑怀林主编的《中国皮肤科学史》，600元/册，欢迎同仁使用该书资料和照片；⑤《中国皮肤性病学书目摘要及著者传略》征文；⑥共建掌上皮肤科APP，签约会诊专家赠送《中国皮肤科学史》1册，签约终端单位和医师个人赠送《皮肤美容化妆品制剂手册》1册。联系人：马振友，QQ：386966727，手机：13379033002。

Effects of high-fat diet on skin wound repair in mice:an experimental study

Cao Wei*,Chen Lei,Wu Yiping,Feng Youping,Huang Li.*Department of Plastic and Aesthetic Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

ObjectiveTo evaluate the effects of long-term high-fat diet on skin wound repair in mice,and to explore its related mechanism.MethodsA total of 16 ten-week-old C57BL/6J wild-type mice were randomly and equally divided into two groups to be fed a high-fat diet（HFD group）and a standard diet（SD group）respectively for 8 weeks.Then,an 8-mm full-thickness skin wound was created on the back of each mouse by using a biopsy punch.The degree of wound healing was observed,wound healing rate and epithelialization level were evaluated every day.The weight of mice was measured before feeding,after 8-week feeding and on day 14 after the operation.Peripheral blood samples were obtained from these mice for the determination of total cholesterol（TC）and triglyceride（TG）levels after a 12-hour fast on day 14 after the operation.Then,all the mice were sacrificed,and wound tissues were resected from the dorsal skin of mice for a histological study.The two-samplettest was used to compare the thickness of new epidermis in the wound surface,collagen deposition rate in the wound bed,count of new vessels,levels of cell proliferation and degree of inflammatory cell infiltration between the two groups.ResultsThe average weight of mice was significantly higher in the HFD group than in the SD group after 8-week feeding（27.3±0.7 g vs.21.2±0.6 g,t=21.98,P＜0.001）and on day 14 after the operation（28.8±0.7 g vs.23.1±1.1 g,t=25.22,P＜0.001）.Similarly,there was a significant increase in the levels of TC（1.35±0.32 mmol/L vs.0.99±0.28 mmol/L,t=2.24,P＜0.05）and TG（4.21±0.41 mmol/L vs.2.71±0.31 mmol/L,t=6.49,P＜0.05）in the HFD group compared with the SD group 14 days after the operation.Compared with the SD group,the HFD group showed shorter healing time（13.5±0.5 days vs.12.6±1.1 days,t=1.99,P＜0.05）,lower thickness of newborn epidermis on the wound surface （47.8 ± 13.8 μm vs.95.7 ± 13.7 μm,t=5.68,P ＜ 0.001）,decreased number of CD31-positive vessels（8±1 vs.13±3,t=4.1,P＜0.001）and count of ki-67-positive cells（21±4 vs.49±10,t=3.33,P＜0.001）,but increased count of infiltrating macrophages and mast cells（bothP＜0.05）.No significant difference was found in collagen deposition rate in the wound bed between the two groups （P ＞ 0.05）.ConclusionLong-term high-fat diet can affect wound healing and delay skin wound repair in mice.

Diet,high-fat;Wound healing;Disease models,animal;Collagen;Mast cells;Macrophages;Blood vessels

Huang Li,Email:hli1212@163.com

作者单位：430030武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院整形美容外科（曹玮、吴毅平、冯幼平、黄立）；中山大学附属第一医院烧伤外科（陈蕾）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.006

湖北省自然科学基金面上项目（2013CFB139）

黄立，Email：hli1212@163.com

2014-10-09）

（本文编辑：尚淑贤）