表面活性剂协同超声波优化牯岭勾儿茶总黄酮提取工艺

俞　浩，毛斌斌，刘汉珍（安徽科技学院食品药品学院，安徽凤阳233100）

表面活性剂协同超声波优化牯岭勾儿茶总黄酮提取工艺

俞浩，毛斌斌，刘汉珍
（安徽科技学院食品药品学院，安徽凤阳233100）

以牯岭勾儿茶总黄酮得率为指标，在单因素实验的基础上，采用正交实验法优选表面活性剂协同超声波提取牯岭勾儿茶总黄酮的提取工艺。结果表明，牯岭勾儿茶总黄酮的最佳提取工艺条件为：液固比35∶1（mL/g），乙醇浓度65%，SDS浓度为3.0 g/L，超声功率250 W，该条件下总黄酮得率为3.81 mg/g，RSD为1.53%，且提取工艺简单，重复性好。

牯岭勾儿茶总黄酮，表面活性剂，超声提取，正交设计法

牯岭勾儿茶（Berchemia kulingensis Schneid）为鼠李科鼠李属植物，主产于安徽、四川、广西等省，其性味微涩、温，具有祛风利湿，通经活络之功效。安徽滁州一带习用牯岭勾儿茶的叶，夏季采收后加工炒制成茶，习称“藤茶”，在当地有着较为悠久的饮用历史。民间认为，长期饮用“藤茶”具有良好的保健功效。近年研究发现，勾儿茶属植物富含氨基酸、多糖、黄酮、苷类等成分，具有保肝、抑菌、止咳平喘等多种药理作用［1］。本实验前期观察了牯岭勾儿茶多糖对免疫功能的影响和抗氧化作用，结果表明牯岭勾儿茶多糖能够增强老龄小鼠非特异性免疫功能和特异性免疫功能，具有抗过氧化损伤作用［2］。目前，有关牯岭勾儿茶黄酮类成分的提取工艺及活性研究尚未见文献报道。本实验在单因素实验的基础上，采用正交设计法优选表面活性剂协同超声提取牯岭勾儿茶总黄酮的最佳工艺，为牯岭勾儿茶的开发利用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

牯岭勾儿茶采自安徽省凤阳县韭山，经安徽科技学院刘汉珍副教授鉴定为牯岭勾儿茶（Berchemia kulingensis Schneid）的叶；芦丁对照品（0080-9905）中国药品生物制品检定所；十二烷基硫酸钠（SDS）无锡市鹿城科技有限公司，分析纯；十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB） 上海凯尔生物科技有限公司，分析纯；吐温80天津市永大化学试剂有限公司，分析纯；椰油酰胺基丙基甜菜碱（CAB） 上海金山经纬化工有限公司，分析纯。

UV-5500PC型紫外可见分光光度计上海元析仪器有限公司；SB 25-12 DTDN型超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-CD型循环水真空泵巩义市予华仪器有限责任公司；FA2104B电子分析天平上海越平科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1芦丁对照品溶液的配制精密称定芦丁对照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.2.2标准曲线的制备取25 mL容量瓶5支，分别加入芦丁对照品溶液1、2、3、4、5 mL，各加蒸馏水至6.0 mL，加1 mL 5%NaNO2溶液，摇匀后放置6 min，加1 mL 10%Al（NO3）3溶液，摇匀后放置6 min，再加10 mL 4%NaOH溶液，最后加蒸馏水定容至刻度，摇匀放置15 min，以相应试剂为空白对照，在510 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得标准曲线方程为：Y=0.071X+0.001，R2=0.9999，芦丁浓度在8.0～4.0 μg/mL范围内线性关系良好。

1.2.3牯岭勾儿茶总黄酮的提取与含量测定取牯岭勾儿茶，粉碎机粉碎后过40目筛，称取2.0 g，置100 mL具塞磨口三角瓶中，加入一定浓度的乙醇，再加入一定量的表面活性剂，浸泡2 h后，置超声装置中，在设定的超声功率下超声一定时间，抽滤，将提取液移入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。取一定体积的提取液，加蒸馏水6 mL，其余步骤同“1.2.2”方法，测定提取液中总黄酮含量，计算牯岭勾儿茶总黄酮得率。牯岭勾儿茶总黄酮得率（mg/g）=提取液中总黄酮质量/牯岭勾儿茶粉末质量。

1.2.4表面活性剂的选择取100 mL具塞磨口锥形瓶5个，分别加入牯岭勾儿茶2.0 g，按液固比30∶1（mL/g）分别加入70%乙醇溶液，其中4个锥形瓶分别加入4 g/L的SDS、CTMAB、吐温80和CAB，第5个锥形瓶中加入相应量的蒸馏水作空白对照。浸泡2 h后，置超声装置中，超声功率250 W，超声时间25 min，取提取液，测定吸光度，得总黄酮得率，计算相对提高率。相对提高率（%）=100×（加表面活性剂总黄酮得率-空白对照总黄酮得率）/空白对照总黄酮得率。

1.2.5单因素实验

1.2.5.1乙醇浓度对总黄酮得率的影响设定超声频率40 kHz，按液固比30∶1，分别加入50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%乙醇，超声功率250 W，超声时间25 min，考察乙醇浓度对总黄酮得率的影响。

1.2.5.2液固比对总黄酮得率的影响设定超声频率40 kHz，按一定液固比加入65%乙醇，设定超声功率250 W，超声时间25 min，考察液固比为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）条件下总黄酮得率。

1.2.5.3超声功率对总黄酮得率的影响设定超声频率40 kHz，按液固比35∶1加入65%乙醇，设定超声时间25 min，考察超声功率为100、150、200、250、300、350、400 W条件下总黄酮得率。

1.2.5.4超声时间对总黄酮得率的影响设定超声频率40 kHz，按液固比35∶1加入65%乙醇，设定超声功率300 W，考察超声时间为10、15、20、25、30、35、40 min条件下总黄酮得率。

1.2.5.5SDS浓度对总黄酮得率的影响设定超声频率40 kHz，按液固比35∶1加入65%乙醇，分别加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0（g/L）的SDS，超声功率300 W，超声时间20 min，考察SDS浓度对总黄酮得率的影响。

1.2.6正交实验优选总黄酮提取工艺参照文献方法［3-5］，根据单因素实验结果，在考察的5个因素中，选取乙醇浓度、液固比、SDS浓度和超声功率等4个对总黄酮得率影响较大的因素，以牯岭勾儿茶总黄酮得率为指标，按照正交实验四因素三水平设计（见表1），选用L9（34）正交表进行正交实验，每个实验号实验重复2次。见表1。

表1　正交设计因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal design

1.3数据处理

结果分析采用SPSS for Windows 17.0软件general linear models。

2　结果与分析

2.1表面活性剂的确定

表面活性剂具有双亲结构，其分子的疏水部分能结合在一起形成胶束，非极性物质可以进入胶束内核或表面活性剂分子之间，从而达到增溶目的［6-8］。因此，表面活性剂在辅助中药提取技术方面应用非常广泛。超声波利用空化作用、机械振荡作用、热效应等原理，使植物细胞壁瞬间破裂，将细胞内容物释放与溶出，且超声波能加速药材成分的扩散，缩短提取时间［9-11］。由表2可知，与未加表面活性剂比较，加入SDS、CTMBA、吐温80、CAB后，牯岭勾儿茶总黄酮得率分别提高了65.14%、49.71%、43.42%、48.00%。4种表面活性剂中，阴离子型表面活性剂SDS对总黄酮得率的影响最大，相对提高率为65.14%。因此，确定SDS为实验因素之一。

表2　不同表面活性剂对总黄酮得率的影响Table 2　Effect of different surfactant on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2单因素实验结果

2.2.1乙醇浓度对总黄酮得率的影响由图1可知，乙醇浓度在50%～65%时，总黄酮得率逐步提高，乙醇浓度为65%时总黄酮得率最高，其后随着乙醇浓度的增加，总黄酮得率逐渐下降。可能原因是随着乙醇浓度的增加，杂质的溶出度也增加，对黄酮的提取造成影响。因此，确定65%乙醇为最佳浓度。

图1　乙醇浓度对牯岭勾儿茶总黄酮得率的影响Fig.1　Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

图2　液固比对牯岭勾儿茶总黄酮得率的影响Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.2液固比对总黄酮得率的影响由图2可知，随着液固比的增加，总黄酮得率逐渐增加，当液固比超过35∶1时，随着液固比的增加，总黄酮得率保持在一个较为平稳的水平。原因可能是随着液固比的增加，提取液粘度降低，超声空化的阻力降低，有助于黄酮的溶出。考虑到液固比提高会增加提取成本，且后期浓缩处理负担也会加重。因此，确定35∶1为最佳液固比。

图3　超声功率对牯岭勾儿茶总黄酮得率的影响Fig.3　Effect of ultrasound power on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.3超声功率对总黄酮得率的影响由图3可知，在一定功率范围内，总黄酮得率随着超声功率的增加不断提高，超声功率为300 W时，总黄酮得率最高。超过300 W后，随着超声功率的增加，总黄酮得率逐步降低，原因可能是功率过高会导致部分黄酮结构破坏。因此，确定300 W为最佳超声功率。

图4　超声时间对牯岭勾儿茶总黄酮得率的影响Fig.4　Effect of ultrasound time on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.4超声时间对总黄酮得率的影响由图4可知，超声时间对总黄酮得率影响不大。可能原因是随着超声时间的延长，总黄酮得率增加，但空化效应减弱，牯岭勾儿茶总黄酮的吸附力增强，也可能是超声时间延长破坏了部分黄酮结构，造成总黄酮得率下降。从总黄酮得率和节约时间方面考虑，确定超声时间为20 min。

图5　SDS浓度对牯岭勾儿茶总黄酮得率的影响Fig.5　Effect of SDS concentration on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.5SDS浓度对总黄酮得率的影响由图5可知，SDS浓度为1.0～2.5 g/L时总黄酮得率随浓度的增加而增加，SDS浓度为2.5 g/L时达最大值，其后逐步降低。可能原因是随着表面活性剂浓度的增加，形成胶束数量不断增加，从而增加黄酮的溶出度，总黄酮得率增加。但当表面活性剂的浓度达到临界胶束浓度后，形成胶束数量不再增加，黄酮得率亦不再增加。因此，选取SDS的最佳浓度为2.5 g/L。

2.3正交实验结果及分析

由表3、表4可知，4个因素对总黄酮得率均有显著影响，影响大小顺序为：C＞B＞D＞A，最佳提取工艺为A2B2C3D1，即液固比35∶1，乙醇浓度65%，SDS浓度3.0 g/L，超声功率250 W。

2.4验证实验

称取3份牯岭勾儿茶样品各2.0 g，采用优化工艺条件提取，3份样品的总黄酮得率分别为3.79、3.82、3.81 mg/g，平均得率为3.81 mg/g，RSD为1.53%，结果表明该工艺条件稳定可行。

表3　正交实验结果Table 3　Results of orthogonal experiment design

表4　方差分析结果Table 4　Results of variance analysis

3　结论

表面活性剂能降低溶剂的表面张力，使溶剂更易渗入药材细胞内部，利于有效成分扩散并溶解于溶剂中，提高中药化学成分的提取效率［12-16］。本实验选择了4种表面活性剂进行实验，结果显示，在相同浓度时，阴离子表面活性剂SDS辅助提取牯岭勾儿茶总黄酮效果最好。在单因素实验的基础上，考察了乙醇浓度、液固比、超声时间、超声功率及SDS浓度对牯岭勾儿茶总黄酮得率的影响，并在此基础上采用正交实验法对提取条件进行了优化，得到最佳提取工艺条件为：液固比35∶1，乙醇浓度65%，SDS浓度为3.0 g/L，超声功率250 W。验证性实验结果显示，采用此工艺条件提取3次，总黄酮平均得率为3.81 mg/g，RSD为1.53%，表明该工艺条件重复性好，为牯岭勾儿茶的开发利用奠定了基础。

［1］陈立，董俊兴.勾儿茶属植物化学成分及其生物活性研究进展［J］.中草药，2006，37（4）：627-630.

［2］俞浩，张孝林，毛斌斌，等.路方方牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠免疫功能及抗氧化能力的影响［J］.食品工业科技，2014，35（5）：350-353.

［3］CAI Ding-jian，SHU Author VitaeQing，XU Bao-quan，et al. Orthogonal test design for optimization of the extraction of flavonid from the fructus gardeniae［J］.Biomedical and Environmental Sciences，2011，24（6）：688-693.

［4］Zhou Shen-kang，Bi Tie-Nan，Xu Yun-Feng，et al.Extraction optimization of carbohydrate compound from Huangqi using orthogonaldesign［J］.InternationalJournalofBiological Macromolecules，2013，58：13-17.

［5］Wu Tao，Yan Jun，Liu Rong-hua，et al.Optimization of microwave-assisted extraction of phenolics from potato and its downstreamwasteusingorthogonalarraydesign［J］.Food Chemistry，2012，133（4）：1292-1298.

［6］王纯荣，郑国栋，颜贤仔.表面活性剂协同微波提取大豆荚黄酮的研究［J］.江西农业大学学报，2011，33（1）：151-156.

［7］董树国，陆钊，曹宏梅.表面活性剂辅助提取桑叶总黄酮的工艺研究［J］.安徽农业科学，2011，39（32）：19778-19780.

［8］Park Ji-yeon，Nam Bora，Choi Sun-A，et al.Effects of anionic surfactant on extraction of free fatty acid from Chlorella vulgari［J］.Bioresource Technology，2014，166：620-624.

［9］Eng AT，Heng MY，Ong ES.Evaluation of surfactant assisted pressurized liquid extraction for the determination of glycyrrhizin and ephedrine in medicinal plants［J］.Anal Chim Acta，2007，583（2）：289-295.

［10］史礼貌，解成喜.新疆大蓟总黄酮的超声提取及抗氧化性研究［J］.食品科学，2011，32（6）：120-123.

［11］Zhang Jun-wei，Wang Yan，Peng Qi-jun.Extraction of Theanine from Waste Liquid of Tea Polyphenol Production in Aqueous Two-phase Systems with Cationic and Anionic Surfactants［J］.Chinese Journal of Chemical Engineering，2013，21（1）：31-36.

［12］潘芳芳，高佳，陈京.正交优化表面活性剂提取山楂黄酮的工艺研究［J］.中国当代医药，2011，18（5）：136-138.

［13］颜贤仔，王纯荣，寇磊.表面活性剂超声法提取野生刺五加黄酮工艺［J］.食品工业科技，2011，32（12）：314-317.

［14］刘树新，侯屹，李祥.超声波-表面活性剂协同提取盾叶薯蓣总皂苷［J］.精细化工，2010，27（6）：562-566.

［15］胡楠，方波，陈晶晶，等.表面活性剂强化微波提取花生壳黄酮的工艺研究［J］.食品科技，2009，34（3）：200-203.

［16］宫坤，詹小龙，郭中婷，等.表面活性剂辅助提取石榴叶中总黄酮工艺的研究［J］.食品工业科技，2014，35（23）：261-264，322.

Optimization of surfactant assisted with ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid

YU Hao，MAO Bin-bin，LIU Han-zhen
（College of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China）

With the index of yield of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid，orthogonal experiment design was used to optimize the surfactant assisted with ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid in the basis of single factor.The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid as follows：SDS concentration 3.0 g/L，ethanol concentration 65%，ultrasonic power 250 W，solvent-solid ratio 35∶1，the yield of total flavonoids was 3.81 mg/g，RSD was 1.53%，and this extraction technology was simple and had good reproducibility.

total flavonoids of Berchemia kulingensis Schneid；surfactant；ultrasonic extraction；orthogonal design

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0244-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.043

2015－01－30

俞浩（1975-），男，博士，副教授，主要从事中药新药及保健食品的开发研制方面的研究，E-mail：yhz_1230@163.com。

安徽省高校省级自然科学研究重点项目（kj2014A051）。