恒温超声辅助提取诃子FRAP类抗氧化活性物质的研究

刘梦莹，江慎华，2，3，*，曲文娟，2，金洪光，廖　亮，马海乐，2，沈勇根，3，徐明生，3（.九江学院药学与生命科学学院，江西九江332000；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏省农产品物理加工重点实验室，江苏镇江2203；3.江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌330045）

恒温超声辅助提取诃子FRAP类抗氧化活性物质的研究

刘梦莹1，江慎华1，2，3，*，曲文娟1，2，金洪光1，廖亮1，马海乐1，2，沈勇根1，3，徐明生1，3
（1.九江学院药学与生命科学学院，江西九江332000；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏省农产品物理加工重点实验室，江苏镇江212013；3.江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌330045）

为了探索恒温超声辅助提取诃子FRAP类抗氧化活性物质提取效果，本文采用该技术首先对提取工艺进行优化，进而通过比较实验和扫描电镜分析该技术提取高效的原因。结果表明，诃子FRAP类抗氧化活性物质恒温超声辅助提取最佳工艺条件为：采用60%乙醇、超声功率180 W、超声频率80 kHz、超声温度70℃；比较分析发现，该工艺提取效率显著高于水浴振荡提取工艺（p＜0.001）；扫描电镜分析发现，恒温超声辅助提取对诃子原料细胞结构破坏更严重，从而增强了提取效率。恒温超声辅助提取技术对诃子抗氧化活性物质提取效率高，本文可为诃子产业化开发提供依据。

恒温超声辅助提取，诃子，抗氧化活性物质，扫描电镜

超声波技术被广泛应用于天然产物中生物活性物质提取［1］。其作用原理主要是空化效应、机械效应和热效应，能加速细胞壁破碎、增加穿透性与传质效应，具有提取时间短、能耗低、提取率高等优点［1］。其中，频率和强度是影响超声提取效率的主要参数［2］。因超声提取中存在热效应，传统超声提取过程中溶液的温度无法稳定，常处于缓慢上升过程，从而影响提取效果［3］。

寻找安全高效的天然抗氧化剂成为食品原料领域的一个研究热点［4］。诃子为使君子科榄仁树属木本科植物诃子（Terminalia chebula Retz）成熟的干燥果实，被誉为“藏药之王”，具有抗氧化、抑制低密度脂蛋白氧化修饰等多种药理功效［5-6］。前人对其抗氧化功能及采用超声辅助技术对诃子抗氧化活性物质提取工艺进行了研究［7-8］。但是，超声频率对诃子抗氧化活性物质提取效率的影响未见报道。同时，传统超声波设备提取过程中温度无法稳定，会逐渐上升，无法真实反应超声提取效果。

本实验室前期研究发现，诃子在卫生部公布的114种可用于保健食品原料中抗氧化活性高居第一［9-11］。因此，本实验在此基础上采用三频恒温数控超声波提取设备，通过仪器自身的控温功能，同时改变频率，对诃子抗氧化活性物质提取工艺进行优化并验证，并将该工艺与水浴振荡提取工艺进行比较，且采用扫描电镜对提取前后的原料进行比较以分析高效原因，以期为开发诃子抗氧化功能食品提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

诃子生产批号：20120701，生产日期：2012年7月5号，产地广西，购自湖南松龄堂中药饮片有限公司，药材买回后计算需求量后粉碎、过60目筛置冰箱中供实验周期内备用；其余化学试剂均为国产分析纯。

KQ-300GVDV型三频恒温数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；UNIC 7200型可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司；VEGA（Ⅱ）LSU型扫描电子显微镜捷克（TESCAN）泰思肯公司；SHA-B恒温振荡器常州国华电器有限公司；DL-5C型离心机上海安亭科学仪器厂；101-1AB型电热鼓风干燥箱天津市泰斯特仪器有公司；DFY-300摇摆式高速万能粉碎机温岭市林大机械有限公司；XW-80A漩涡混合器上海青浦沪西仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1恒温超声辅助提取FRAP类抗氧化物质称取5.000 g诃子粉末于150 mL具塞锥形瓶中进行恒温超声提取，每次提取后离心，共提取3次，上清液合并、定容成统一体积，稀释400倍后测定FRAP值评价提取率。其中，料液比是指诃子粉质量（g）与提取溶剂体积（mL）的比例。

1.2.2单因素实验设计

1.2.2.1超声时间单因素实验固定提取条件：1∶20料液比、60%乙醇、超声功率240 W、超声频率45 kHz、超声温度60℃。选定超声时间3、5、7、9、11、13、15 min做时间单因素实验。

1.2.2.2超声频率单因素实验固定提取条件：1∶20料液比、60%乙醇、超声功率240 W、超声时间9 min、超声温度60℃。选取超声频率45、80、100 kHz做超声频率单因素实验。

1.2.2.3超声功率单因素实验固定提取条件：1∶20料液比、60%乙醇、超声频率45 kHz、超声时间9 min、超声温度60℃。选取超声功率120、150、180、210、240、270、300 W做超声功率单因素实验。

1.2.2.4超声温度单因素实验固定提取条件：1∶20料液比、60%乙醇、超声功率210 W、超声时间9 min、超声频率45 kHz。选取温度40、45、50、55、60、65、70、75、80做超声温度单因素实验。

1.2.2.5乙醇浓度单因素实验固定提取条件：1∶20料液比、超声功率210 W、超声时间9 min、超声频率45 kHz、超声温度70℃。选取乙醇浓度30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%做乙醇浓度单因素实验。

1.2.2.6料液比单因素实验固定提取条件：60%乙醇、超声功率210 W、超声时间9 min、超声频率45 kHz、超声温度70℃。选取料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40做料液比单因素实验。

1.2.3正交实验在单因素实验的基础上，设计4因素3水平［L9（34）］正交实验，其因素水平如表1所示，以FRAP值衡量提取效率。

表1　恒温超声辅助提取诃子抗氧化活性物质正交实验Table 1　The orthogonal experiments of UAECTT for extacting antioxidants from TCR

1.2.4验证实验选取恒温超声辅助提取最佳工艺与正交实验中FRAP值最高实验组进行比较和验证，由此证明该最优提取工艺的可靠性。

1.2.5恒温超声优化工艺与水浴振荡优化工艺提取效率的比较为了衡量恒温超声提取效率，将该工艺与实验室前期确定的水浴振荡最佳提取工艺进行了比较。

1.2.5.1超声优化提取实验提取条件：1∶20料液比、超声功率210 W、超声时间9 min、超声频率80 kHz、超声温度70℃、乙醇浓度60%、提取次数3次。

1.2.5.2水浴振荡提取实验提取条件：1∶20料液比、水浴时间7 min、水浴温度70℃、乙醇浓度50%、提取次数4次。

1.2.6指标的测定

1.2.6.1总多酚含量的测定采用江慎华等［12］方法测定总多酚含量。取稀释10倍后的Folin试剂稀释液2.25 mL加入到0.5 mL样液中，然后加入2.25 mL 6%的无水碳酸钠溶液，振荡均匀、35℃水浴中静置90 min后于波长765 nm处读数。将没食子酸配成质量浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150 μg/mL 8个样液制作标准曲线，得回归方程：y=0.0134x+0.0332（r=0.9981）。

1.2.6.2FRAP法抗氧化活性的测定用江慎华等［12］方法，略作改进，具体步骤如下。

取100 μL样液同1.0 mL FRAP工作液混合均匀，37℃反应40 min后，于波长593 nm测定吸光度，吸光度越高抗氧化能力越强。FRAP工作液由0.3 mol/L pH3.6的乙酸钠缓冲液（3.1 g三水乙酸钠和16 mL冰乙酸溶于1000 mL蒸馏水中即得）、10 mmol/L TPTZ溶液（TPTZ溶液采用40 mmol/L优级纯HCl溶解）和20 mmol/L三氯化铁以体积比10∶1∶1混匀，现用现配。将FeSO4·7H2O配成浓度为0、100、200、400、600、1000 μmol/L的样液制作标准曲线，得曲线方程y= 0.0017x+0.0972（r=0.9946），FRAP值计算公式如下：

式中：W—FRAP值，诃子抗氧化活性物质提取率，μmol/g；C—FRAP摩尔浓度，每升提取液中所含抗氧化活性物质微摩尔数，μmol/L；U—稀释倍数；V—定容体积，L；m—原料质量，诃子粉末质量，g。

1.2.7扫描电镜微观结构分析将恒温超声提取和水浴振荡提取后的样品粉末60℃烘干后过60目筛。筛选后取少量诃子粉末在离子溅射仪中完成真空喷镀后进行扫描电子显微镜分析。

1.2.8数据处理实验均三次重复，结果以平均值±标准偏差表示。采用Excel和DPS软件对实验数据进行整理及统计分析。

2　结果与分析

2.1诃子抗氧化活性物质提取单因素实验

2.1.1超声时间单因素实验时间单因素实验结果如图1所示。由图1可以看出，恒温超声提取3～9 min范围内，诃子提取液FRAP值随着超声时间的延长而升高，当超声时间达到9 min时含量达到最大值，此后随着超声时间的延长该值逐渐减少。在3～9 min时间段，由于超声空化效应，加速了植物原料的溶胀和水合作用，从而提高有效成分得率［15］。恒温超声提取9 min后提取率降低可能是因为加热时间延长而致提取出的一些热敏性成分转化降解［3］。尽管9 min提取率最高，但是，统计分析发现其与相邻的7 min和 11 min的提取效率并没有显著性差异（p＞0.05）；同时，因原料本身经过泡制等处理，导致在很短时间（9 min）内提取率即能达到最高。因此，固定提取时间为9 min做正交实验。

图1　超声辅助提取时间单因素实验Fig.1　Results of extraction time experiment by UAECTT

2.1.2超声频率单因素实验根据三频恒温数控超声波清洗器固有的三种频率设置超声频率对诃子抗氧化活性物质提取的影响结果如图2所示。由图2可知，随着超声频率增大，提取液FRAP值逐渐降低。超声波频率与波长成反比，随着频率增加，其波长随之减低，造成声波在传播过程中衰减加快，进而影响到对细胞的破碎效率［17］；而且频率与振幅也成反比，频率低则振幅高，使单次的空化和剪切力等作用增强［18］。基于以上原因，造成提取液FRAP值含量随频率升高而下降。吴熙［19］和胡殿丽等［20］在研究超声提取木蝴蝶总黄酮和黄柏小檗碱时也得到了相似结果。本实验选定超声频率45、80、100 kHz做正交实验。

图2　超声辅助提取频率单因素实验Fig.2　Results of ultrasonic frequency experiment by UAECTT

2.1.3超声功率单因素实验功率单因素对实验的影响结果见图3。可以看出，在超声功率120～210 W范围内，提取液FRAP值随着超声功率的增大逐渐增大；当提取功率大于210 W以后，提取液FRAP值随着时间的增加反而逐渐降低。超声波通过液体介质时，大量的气泡会产生、破裂，导致强烈声冲流的形成；超声产生的烈震波和高速喷射使得原料分子溶胀，进而使有效成分加速进入提取溶剂［16］，一定超声功率范围，促进诃子抗氧化活性物质溶出。当功率过高时，造成温度过高会促使某些多酚类抗氧化活性物质的分解［3］。同时，随功率增加，杂质溶出增加，使诃子抗氧化活性物质的提取率降低［3］。本实验选定提取功率180、210和240 W做正交实验。

图3　超声辅助提取功率单因素实验Fig.3　Results of ultrasonic power experiment by UAECTT

2.1.4超声温度单因素实验温度单因素实验结果见图4。在40～70℃温度范围内，提取液FRAP值随超声温度升高而逐渐上升，70℃达最高，当超过70℃后反而下降。其原因可能是，在低温时，超声波未能将细胞彻底破碎，有效成分溶解度较低；随着温度升高，分子热运动加速，进一步破碎细胞结构，溶液扩散进入细胞速度加快［21］，从而提高诃子抗氧化活性物质的提取率。但是，随温度增加接近至溶剂沸点时，会因为溶剂汽化而减少固液间的有效接触面积，提取速率反而下降。此外，高温容易使热不稳定的抗氧化活性物质降解［22］。选定65、70、75℃做正交实验。

图4　超声辅助提取温度单因素实验Fig.4　Results of ultrasonic temperature experiment by UAECTT

2.1.5乙醇浓度单因素实验乙醇浓度对诃子抗氧化活性物质提取的影响结果如图5所示。从图5可以看出，在30%～60%的浓度范围内，提取液FRAP值随着乙醇浓度的增大而快速上升，60%时达最大，在70%～90%范围内反而下降较快。植物体内的多酚部分与蛋白质等通过氢键或疏水键结合的形式存在于细胞壁中。当乙醇浓度过高时，会使蛋白质变性，使与之结合的抗氧化活性物质的溶出减少［13］；同时可能因溶剂挥发增大，醇溶性杂质溶出增加，而干扰与之结合的抗氧化活性物质的溶出［14］。因此选定50%、60%和70%乙醇做正交实验。

图5　超声辅助提取乙醇浓度单因素实验Fig.5　Results of ethanol concentration experiment by UAECTT

2.1.6料液比单因素实验料液比对诃子抗氧化活性物质提取的影响结果如图6所示。随着提取料液比增大，提取液FRAP值逐渐增加，当料液比达到1∶20后，提取液FRAP值变化不大。超声波传递产生的声空化使溶剂空洞即空化气泡形成，在液体介质中其可通过改变自身大小来释放大量能量，空化气泡破裂时的能量不仅使细胞壁孔增大，而且促使细胞壁破裂，提高有效成分质量传递，进而提高得率。但随着料液比的增大，空穴作用强度降低，当超过一定范围时，介质的自然凝聚力增强，少部分区域形成负压，从而抑制空化作用［15］。因此，综合考虑生产成本和后续处理，正交实验选定料液比1∶20为固定参数。

图6　超声辅助提取料液比单因素实验Fig.6　Results of solvent to solid ratio experiment by UAECTT

2.2恒温超声辅助提取诃子FRAP抗氧化活性物质正交实验

根据上述单因素实验结果确定的四因素三水平正交实验结果如表2所示。由表2可以看出，影响超声辅助提取诃子抗氧化活性物质的因素从大到小排序依次为：乙醇浓度＞超声频率＞超声温度＞超声功率，最佳提取工艺为：A2B2C1D2，即提取乙醇浓度60%、超声频率80 kHz、超声功率180 W、超声温度70℃。由方差分析表3可见，乙醇浓度、超声频率和超声功率三个因素对提取结果均产生极显著性影响（p＜0.01）。

2.3验证实验

选取超声辅助提取优化工艺（A2B2C1D2）与正交实验中FRAP值最高组（A2B2C3D1）进行验证实验。按照正交最佳工艺所得提取液FRAP值［（5429.65± 21.18）μmol/g］极显著性高于正交表中FRAP值最高组［（5274.35±37.35）μmol/g］（p＜0.001）。由此证明该最优提取工艺较为可靠，可以考虑作为后续扩大提取工艺的提取条件。

2.4恒温超声辅助与水浴振荡提取效率的比较

水浴振荡提取液FRAP值和总多酚含量分别（4987.29±47）μmol/g及（0.294±0.0063）g/g，恒温超声提取液FRAP值和总多酚含量分别达（5401.41± 28.23）μmol/g及（0.313±0.0045）g/g。前者提取液FRAP值和总多酚含量分别仅为后者的92.33%及93.93%，具有极显著性差异（p＜0.001）。比较结果说明恒温超声辅助法提取效率优于传统水浴振荡提取方法。Cheung Y［23］和Chen等［24］从药用真菌和纤孔菌属中提取多糖时比较了超声辅助提取法和水浴振荡法，也得出与本实验相似的结论。

2.5采用扫描电镜对样品微观结构分析

未经过提取处理的诃子粉末其组织表面光滑，结构致密完整，但经过超声优化提取9 min与水浴振荡提取7 min后，其组织和细胞内部结构变得松散，并均遭受到不同程度的破坏（图7）。相比较而言，水浴振荡提取7 min后，诃子的细胞内部结构更为致密、光滑；而经过超声提取后，粉末内部的组织成分无法识别，细胞微观结构遭到更严重的破坏。其主要的原因可能是超声提取产生的机械粉碎等作用使诃子细胞壁破裂，改变其内部结构，产生空化效应并增加了传质速率，进而使有效成分提取率增加［25-26］。在空穴作用中，液体介质产生气泡，并随声波增强而增多，空穴作用导致温度和压强大幅度升高，使泡沫崩解，产生猛烈的冲击波，加强溶剂系统内的传质过程。随后，超声波扩散通过细胞壁并使其破碎，细胞内容物迅速溶出［27］。Balachandranl［28］研究超声提取和水浴振荡提取姜中刺激性化合物组分时，也从电镜图像中观察到与本文相类似的结果。

表2　恒温超声辅助提取诃子抗氧化活性物质正交实验Table 2　Orthogonal experiments for extracting antioxidants from TCR by UAECTT

表3　恒温超声辅助提取诃子总多酚正交实验方差分析Table 3　Analysis of orthogonal experiments

图7　诃子粉末恒温超声、水浴振荡提取前后扫描电镜微观结构比较（2500×）Fig.7　The microcosmic comparasion of TCR powders by scanning electron microscope among native powders，UAECTT powders and WBOE powders（2500×）

3　结论

3.1通过单因素和正交实验，以FRAP值为评价指标确定了恒温超声辅助提取诃子抗氧化活性物质的最佳工艺为：乙醇浓度60%、超声频率80 kHz、超声功率180 W、超声温度70℃，在此条件下提取液FRAP值可达（5429.65±21.18）μmol/g。

3.2比较实验发现，恒温超声辅助最佳工艺提取效率显著性高于水浴振荡最佳工艺（p＜0.001），可考虑用于后续对诃子抗氧化活性物质提取。

3.3扫描电镜结果表明，与水浴振荡提取相比，恒温超声提取对原料粉末产生更强的破坏作用，并使其组织和细胞的微观结构比提取前破坏更严重，增加溶剂向胞内浸透速率，使得诃子内抗氧化活性物质迅速、充分溶出，提取效率显著提高。

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The FRAP antioxidants extraction from Terminalia chebula Retz based on ultrasound assisted extraction with constant temperature

LIU Meng-ying1，JIANG Shen-hua1，2，3，*，QU Wen-juan1，2，JIN Hong-guang1，LIAO Liang1，MA Hai-le1，2，SHEN Yong-gen1，3，XU Ming-sheng1，3
（1.School of Pharmacy and Life Science，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China；2.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu Provincal Key Lab of Physical Processing of Agricultural Products，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；3.College of Food Science and Engineering，Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Foods，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

In order to explore the extracting effect of antioxidants from Terminalia chebula Retz（TCR）based on ultrasound assisted extraction with constant temperature technology（UAECTT），at first，the extraction technology of antioxidants were optimized，then the reasons for high efficiency of this extraction technology were analysized by comparative experiments and scanning electron microscope（SEM）.The optimal parameters of the extracting technology were as follows the concentration of ethanol 60%，the ultrasound frequency 80 kHz，the ultrasound power 180 W，and the extracting temperature 70℃.The extraction efficiency of UAECTT dramaticlly was higher than that of water bath oscillator extraction（WBOE）（p＜0.001）based on the comparative analysis.A comparison of SEM images of TCR powders indicated the extraction efficiency was higher treated by UAECTT with the more serious disruption of cell structure and the more sufficient interaction.The technology of UAECTT was proved as one technology with high efficiency for extracting TCR antioxidants and this study provided the basis for future industrializing development of TCR.

ultrasound assisted extraction with constant temperature；Terminalia chebula Retz；antioxidants；scanning electron microscope

TS201.2

B

1002-0306（2015）20-0238-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.042

2015－03－09

刘梦莹（1993-），女，大学本科，主要从事天然产物研究与开发方面的工作，E-mail：1048188096@qq.com。

江慎华（1973-），男，博士，副教授，主要从事天然产物研究与开发方面的工作，E-mail：jiangshenhua66@163.com。

江苏省青年自然科学基金（BK2012287）；国家自然科学基金（31360371）；江西省自然科学基金（20132BAB204030）；江西省科技支撑计划（20123BBF60150）；江苏省农产品物理加工重点实验室开放课题（JAPP2010-5）；江西省高等学校大学生创新创业计划项目；江西省天然产物与功能食品重点实验室开放基金；九江市科技支撑计划（201438）。