安晓婷,谢小花,陈 静,肖陆飞(滁州职业技术学院食品与环境工程系,安徽滁州239000)
滁州绿茶儿茶素组成及其抗氧化活性
安晓婷,谢小花,陈静,肖陆飞*
(滁州职业技术学院食品与环境工程系,安徽滁州239000)
采用超高液相色谱(Ultra high performance liquid chromatography,UPLC)分析了7种滁州绿茶的儿茶素组成,并采用总抗氧化能力法(Total antioxidant capacity assay,TEAC)评价了7种绿茶的抗氧化能力。结果表明,7种滁州绿茶的儿茶素含量均较丰富,其中阳春白雪一级儿茶素含量最高,为78.93 mg/g。7种绿茶的表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate,EGCG)含量在24.28~33.89 mg/g之间,是含量最丰富的儿茶素单体。除此之外,滁州绿茶中没食子儿茶素((-)-Gallocatechin,GC)、表没食子儿茶素((-)-Epigallocatechin,EGC)和表儿茶素没食子酸酯((-)-Epicatechin gallate,ECG)的含量也较高。抗氧化活性实验证明,总儿茶素、EGCG和ECG的含量与滁州绿茶抗氧化能力具有显著的相关性。
滁州绿茶,儿茶素,超高液相色谱(UPLC),抗氧化活性
绿茶是世界上消费量最大的饮料之一,长期饮用绿茶可以降低心血管疾病和肿瘤的发病率[1]。大量研究表明,绿茶中的茶多酚尤其是儿茶素是绿茶中的主要功能活性成分[2-3]。儿茶素是天然抗氧化剂[4],具有抗氧化清除自由基、降低肿瘤致死率、降低心血管疾病的风险、降血脂、抑制脂肪吸收、防治Ⅱ型糖尿病、延缓衰老、抗炎、延缓神经组织退化和抗菌的作用[5-8]。绿茶中富含(-)-EGCG,(-)-EC,(-)-ECG,(-)-EGC,(+)-C等儿茶素,其中(-)-EGCG的含量最高且生理活性最强[9]。
作为安徽省的特色绿茶资源,滁州绿茶有悠久的历史。滁州绿茶前身为南谯贡茶[10],《安徽茶经》中记载,“宋朝,池州九华和六安寿州的龙芽,休宁的白岳金芽,全椒南谯茶,都是名茶,驰名全国”。滁州绿茶年产近数十万,其芽叶细嫩,叶底嫩绿明亮,汤色嫩黄绿清澈,有着广泛的消费人群。目前,我国绿茶品种中,关于如西湖龙井、信阳毛尖、黄山毛峰等研究较多,它们多酚组成和生物学活性均有大量报道[11-13]。而作为一种地方特色天然抗氧化资源,滁州绿茶的目前受到的关注较少。
本文选取7种具有代表性的滁州绿茶,通过超高效液相色谱(UPLC)研究其儿茶素组成,并通过TEAC法评价其自由基清除能力,综合比较不同茶叶抗氧化能力差异及其与八种儿茶素之间的相关性,为更好的开发和利用滁州绿茶资源提供理论基础。
1.1材料与仪器
7种滁州绿茶均于2014年采自滁州施集茶厂,其中施集烘青一级采摘时间为5月1日,施集烘青特级采摘时间为2014年4月25日,施集毛峰特级采摘时间为4月12日,施集毛峰一级采摘时间为4月18日,阳春白雪一级采摘时间为4月5日,阳春白雪特级采摘时间为4月1日,阳春白雪极品采摘时间为3月26日;没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG),表儿茶素没食子酸酯(ECG)和儿茶素没食子酸酯(CG)等8种儿茶素单体均购自美国Sigma-Aldrich;2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS) 购自阿拉丁试剂(上海)有限公司;6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox) 购自百灵威科技(北京);其余试剂均为国产分析纯。
Agilent 1290 Infinity LC超高液相色谱仪美国Agilent公司;52S紫外可见分光光度计上海棱光技术有限公司;THZ-Q台式冷冻恒温振荡器太仓市华美生化仪器厂。
1.2实验方法
1.2.1儿茶素提取取1 g绿茶样品在液氮中磨碎,在50 mL 60%乙醇(含0.2%甲酸)中40℃下振荡提取12 h,离心力5000×g下离心30 min,取上清液用60%的乙醇在50 mL容量瓶中定容[14]。
1.2.2UPLC条件色谱柱:Zorbax SB-C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),美国Agilent公司。以含0.1%甲酸的水溶液为流动相A,含0.1%甲酸的乙腈溶液为流动相B,流速0.4 mL/min,柱温为30℃,进样量为0.5 μL,按照如下梯度洗脱:0~5 min,2%~10%B;5~8 min,10%~15%B;8~15 min,15%~50%B;15~20 min,50%~70%B;20~25 min,70%~85%B;25~35 min,85%B;Post Run 5 min。采用DAD检测器,检测波长为278 nm。配制浓度梯度标准品溶液,绘制浓度-峰面积标准曲线,采用峰面积归一法计算绿茶中8种儿茶素含量。
1.2.3总抗氧化能力(TEAC)测定参照Miller等[15]的方法略作改动。将5 mL 7 mmol/L ABTS+·和88 μL 140 mmol/L过硫酸钾混合,形成ABTS+·自由基储备液,避光保存,使用前用无水乙醇稀释成工作液,要求其在30℃、734 nm波长下吸光度为0.700±0.02。取100 μL梯度浓度待测液(烘青一级、烘青特级、毛峰一级、毛峰特级、阳春白雪特级为500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000 μg/mL;阳春白雪一级和阳春白雪极品为200、400、600、800、1000、1200、1400、1600、2000 μg/mL),空白管加入100 μL 80%乙醇,最后加入3.9 mL ABTS+·工作液,振荡30 s,室温下静置6 min后,在734 nm处测吸光值变化。按下式计算ABTS+自由基清除率:
式中:Ai为加入待测液的吸光值;Aj为待测液的本底值;A0为不加待测液的对照值。IC50为对ABTS+自由基清除率达到50%时的样品浓度。另以不同浓度Trolox(50、10、150、200、250、300、800、1000 μg/mL)做清除ABTS+自由基的曲线,Trolox的IC50除以样品的IC50作为样品的总抗氧化力,单位为mg Trolox equivalent(TE)/g。
1.2.4数据分析使用SPASS 14.0软件,采用ANOVA法进行显著性检验。选取p<0.05为显著水平。
2.1儿茶素组成分析
7种滁州绿茶中儿茶素的UPLC分析如图1所示,8种儿茶素单体在UPLC中均得到了高效、快速的分离。通过儿茶素标品峰面积归一法测定滁州绿茶中每种儿茶素的含量,得到7种滁州产绿茶的儿茶素组成(表1)。7种绿茶的EGCG含量在24.28~33.89 mg/g之间,是滁州绿茶中含量最高的儿茶素,除此之外,绿茶中GC、EGC和ECG的含量也较丰富(图2),而另外四种儿茶素C、EC、GCG和CG的含量较低。其中CG的含量最低,不足EGCG的1%,烘青特级和阳春白雪一级中甚至未能检测到CG。Friedman等[16]综合分析了24种美国商业绿茶中的儿茶素含量,发现其中EGCG和ECG的含量最高,不同绿茶品种的EGC含量差异很大,在0~14.2 mg/g之间。另外,该研究发现CG的平均含量最低,低于1 mg/g,与本文报道较为一致。
图1 7种滁州绿茶儿茶素UPLC中分离及紫外检测(278nm)Fig.1 UPLC separation and UV detection(278nm)of catechins of 7 green teas in Chuzhou
图2 滁州绿茶中主要儿茶素单体Fig.2 Major catechin monomers in green teas in Chuzhou
表1 7种滁州绿茶中主要儿茶素含量(mg/g)Table 1 Content of major catechin individuals in 7 green teas in Chuzhou(mg/g)
由表1可知,阳春白雪的GC、C、ECG含量分别介于15.43~22.59、1.13~2.60、10.82~17.73 mg/g之间,显著高于毛峰和烘青,而EGC含量完全呈相反趋势,为烘青>毛峰>阳春白雪。另外,其他几种儿茶素未表现出明显的品种规律性。不同品种绿茶儿茶素含量差异较大,阳春白雪一级的儿茶素总量最高,为78.93 mg/g,其次为阳春白雪极品,总量为77.77 mg/g,而烘青特级的儿茶素总量最低,为57.59 mg/g。3种阳春白雪的儿茶素平均总量为73.82 mg/g,稍低于毛峰(74.36 mg/g),而烘青最低,为63.85 mg/g。阳春白雪和烘青品种内儿茶素总量差异显著(p<0.05),而毛峰一级和二级的儿茶素总量无显著性差异(p>0.05)。由此可以推断,茶叶的叶片种类、叶龄、采摘时间以及制作工艺都会对绿茶的儿茶素含量造成影响。
根据Friedman等的研究结果[16],24种美国消费量最大的商业绿茶中只有8种绿茶的儿茶素含量在50 mg/g以上,而7种滁州绿茶的儿茶素含量均高于57 mg/g。西湖龙井的EC、ECG、EGC和EGCG的含量分别为5.27、9.97、28.07、35.46 mg/g[11],其中EGC的含量稍高于滁州绿茶,而其余3种儿茶素的含量与滁州绿茶差异不大。另有报道指出龙井茶中GC含量低于1 mg/g,显著低于滁州绿茶[12]。云南大叶青茶中GC、EGC、EGCG、EC、ECG的含量分别为1.317、9.479、27.98、7.872、15.000 mg/g[17],其中EC含量高于滁州绿茶,GC含量显著低于滁州绿茶。四川峨眉绿茶与云南大叶清茶GC含量相近,显著低于滁州绿茶,而四川峨眉绿茶中EGCG含量高达51.692 mg/g,显著高于滁州绿茶[17]。在安徽省内绿茶中,六安瓜片和黄山毛峰的EGCG含量分别为64.3、93.9 mg/g,显著高于滁州绿茶,而两者的GC含量分别为0.3 mg/g和1.4 mg/g,显著低于滁州绿茶,其余6种儿茶素单体的含量差异不明显[12]。综上所述,滁州绿茶相对于其他绿茶的主要优势在于丰富的GC含量。GC是一种自然界中稀有的儿茶素单体,具有重要的生理功能。七种滁州绿茶中GC含量介于7.97~22.59 mg/g之间,可以用来分离、制备GC单体。
2.2总抗氧化能力分析
采用TEAC法评价绿茶的抗氧化能力。Trolox与阳春白雪一级、烘青特级的自由基清除能力如图3所示。由图3可知,在同等浓度下,阳性对照Trolox的ABTS+自由基清除能力显著强于绿茶,Trolox在浓度为300 μg/mL时自由基清除率接近100%。与Trolox的清除曲线相似,绿茶“阳春白雪一级”和“烘青特级”的自由基清除率随浓度增加先呈直线上升,达到最高值(接近100%)之后平稳。两种绿茶达到最高自由基清除率的浓度分别在1400 μg/mL和4000 μg/mL附近。通过方法1.2.3计算7种滁州绿茶的IC50和TEAC值,如表2所示,在7种绿茶中,阳春白雪一级的IC50值最低(712.34 μg/mL),TEAC值最高,为173.62 mg TE/g,它的自由基清除能力最强;而烘青特级的IC50值最高,为2021.17 μg/mL,因此它的自由基清除能力和TEAC值在7种绿茶中最低。
图3 Trolox与两种绿茶ABTS+自由基清除曲线Fig.3 ABTS free radical scavenging curves of Trolox and two green teas
表2 7种滁州绿茶IC50值和TEAC值Table 2 IC50value and TEAC value of seven green teas in Chuzhou
进一步研究儿茶素含量与抗氧化能力的相关性,结果如图4所示,7种滁州绿茶TEAC值与儿茶素总量、EGCG和ECG含量存在一定的线性关系。其中,儿茶素的总量与TEAC值的相关性最高,相关系数(R2)为0.814,与绿茶抗氧化活性呈极显著正相关(p<0.01)(表3),证明儿茶素是绿茶中主要的抗氧化活性物质,周金伟等研究同样证明,茶多酚和儿茶素的含量是绿茶抗氧化能力强弱的主要因素[18]。与儿茶素总量相比,EGCG和ECG与绿茶抗氧化能力的相关系数低,分别为0.513和0.672,但均与绿茶抗氧化能力呈显著正相关(p<0.05)。其他6种儿茶素中,GC、C、EC、CG与TEAC值呈正相关,而EGC和GCG与TEAC值呈负相关,但均无统计学意义(p>0.05)。综上所述,酰化儿茶素EGCG与ECG是滁州绿茶中抗氧化能力最强的儿茶素,这或许与它们C环3号位的没食子酸残基相关。相关研究表明,C环3号位的没食子酸残基对儿茶素生物学活性具有重要影响[19]。另有研究证明,相对于EGC和EC,没食子酸酰化的EGCG和ECG具有更强的抗肿瘤能力[20]。
图4 儿茶素总量、EGCG含量、EGC含量与TEAC值的相关性Fig.4 Correlation between total catechin content,EGCG content,and EGC content with TEAC value
表3 儿茶素含量与绿茶TEAC值的相关系数Table 3 The correlation coefficients of TEAC value and catechin content of green tea
采用UPLC快速准确的测定了7种滁州产绿茶中儿茶素组成,结果表明,7种滁州绿茶均含有丰富的儿茶素,其中,阳春白雪一级中的儿茶素总量最高,为78.93 mg/g,而烘青特级的儿茶素总量最低,为57.59 mg/g。儿茶素单体中,EGCG的含量在24.28~33.89 mg/g之间,是滁州绿茶中含量最丰富的儿茶素单体,除此之外,GC、ECG和EGC的含量也较丰富。通过TEAC法评价滁州绿茶的抗氧化活性,发现儿茶素总量、EGCG和ECG含量与滁州绿茶抗氧化能力具有显著的相关性,是滁州绿茶中主要的抗氧化活性物质。滁州绿茶中儿茶素含量丰富,抗氧化能力强,具有广阔的开发利用前景和较高的饮用价值。
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Catechin composition and antioxidant capacity of green teas in Chuzhou
AN Xiao-ting,XIE Xiao-hua,CHEN Jing,XIAO Lu-fei*
(Department of Food and Environmental Engineering,Chuzhou Vocational and Technical College,Chuzhou 239000,China)
UPLC was applied to analyze the catechin composition in seven varieties of green teas,and their antioxidant capacity was further evaluated by TEAC assay.Results showed that green teas in Chuzhou were rich in catechin and YangChunBaiXue first level tea possessed the highest content of catechin,which was 78.93 mg/g.The content of EGCG of green teas ranged from 24.28 to 33.89 mg/g and it was the most abundant catechin monomer in Chuzhou green teas.In addition,Chuzhou green teas also exhibited high levels of GC,EGC and ECG.Furthermore,the content of total catechin,EGCG,and ECG revealed high significant correlation with antioxidant activity of green teas.
Chuzhou green teas;catechin;ultra high performance liquid chromatography(UPLC);antioxidant capactiy
TS207.3
A
1002-0306(2015)20-0137-05
10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.020
2015-03-01
安晓婷(1986-),女,硕士,助教,研究方向:营养与功能因子,E-mail:anxiaotin@163.com。
肖陆飞(1976-),男,博士,副教授,研究方向:有机合成,E-mail:foodjys@126.com。
安徽省省级示范实验实训中心建设项目(20101427);安徽省卓越人才培养计划(2013zjjh051)。