超声波对桑葚花色苷中矢车菊素稳定性的影响

马　　琳，赵瑞洁，李京阳，贾一凡，张亚杰，陈　　健，2，*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京100083；2.北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京100083）

超声波对桑葚花色苷中矢车菊素稳定性的影响

马琳1，赵瑞洁1，李京阳1，贾一凡1，张亚杰1，陈健1，2，*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京100083；2.北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京100083）

为了探讨在食品加工中超声波处理对富含花色苷原材料的影响，本文以桑葚中的花色苷-矢车菊素为研究对象，研究超声波处理对其稳定性及抗氧化活性的影响，对处理过程中羟基自由基的清除与花色苷的降解进行相关性分析。实验结果显示，超声波处理会导致花色苷部分降解，且随强度增大，花色苷稳定性明显降低，抗氧化能力减弱。当功率由200W增加至500W，处理时间由15min增长至90min时，样品对·OH的清除率平均下降40%；抗氧化活性下降5%～70%。

超声波，花色苷，矢车菊素，稳定性，抗氧化活性，羟基自由基

桑葚又名桑枣、桑果、桑实、葚子、乌葚等，系桑科、桑属植物［1］。果实有柄，椭圆形，深紫色或黑色，少有白色；花期4～5月，果期6～7月，通常于4～6月桑葚呈红紫色时采收。质油润，富糖性，气微，味微酸而甜，以个大、肉厚、紫红色、糖性大者为佳［2］。陈亮［3］研究结果表明：野生桑葚总花色苷含量为154.27mg/100g，含有的三种花色苷成分分别为矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，其相对含量为67.52%、31.29%和1.06%。

花色苷是自然界最重要的一种功能性色素之一，安全、无毒，能够保护植物抵抗虫害以及预防植物的紫外线照射损伤，而且对人类具有许多生理保健功能，如清除体内自由基、抗肿瘤、抗脂质过氧化、保护肝脏等［4］，已被广泛应用于食品、医药等行业。

超声波指频率高于20kHz的一种高频机械波，其特点是频率高、波长短、功率大、穿透力强［5］。在食品加工中利用超声波空化效应在液体中产生的局部瞬间高温及温度交变变化、局部瞬间高压和压力变化，可使某些细菌致死、病毒失活，甚至使体积较小的微生物的细胞壁破坏，从而延长保鲜期，保持食物原有风味［6］。超声波因其处理过程中无化学残留、安全性高等优点，在食品加工领域得到广泛应用，如超声辅助提取、助滤、灭菌、钝酶、脱气、干燥、清洗、食品添加剂的合成、食品品质的检测等［7-8］。然而有研究表明，超声波在加工应用中会降低花色苷的稳定性，造成其部分降解，降低商品价值。为此，本实验选用桑葚中含量最高的花色苷—矢车菊素为对象，探讨超声波强度及处理时间对花色苷稳定性的影响。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

桑葚购于河南洛阳孟津县，于4℃冷藏保存；甲醇、三氟乙酸、乙酸乙酯、亚油酸分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司；醋酸钠、乙酸、盐酸、六水合氯化铁北京蓝弋化学试剂公司；Tween-20LR，购于美国Sigma公司；Amberlite XAD-7树脂北京金锐林科技发展有限公司；三吡啶-三吖嗪［1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine，TPTZ，99%］、1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，·DPPH，96%） 美国Aladdin公司；Trolox（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）（上海）化成工业发展有限公司。

Amberlite XAD-7层析柱26mm×70cm，北京普瑞因生物色谱技术有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司；RE-52旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；W201B恒温水浴锅上海申顺生物科技有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵上海知信实验仪器技术有限公司；LD4-2低速离心机北京医用离心机厂；AL104电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Infinite M200多功能酶标仪瑞士Tecan公司；JAC-Ⅳ超声波细胞粉碎机济宁市奥波超声波电气有限公司。

1.2实验方法

1.2.1矢车菊素的分离采用陈健［9］的方法提取和纯化桑葚花色苷中的矢车菊素。桑葚用组织捣碎机破碎后，用2L含0.5%三氟乙酸的甲醇在0℃浸提24h后4800r/min离心15min，在38℃下旋转蒸发除去甲醇，得到花色苷提取物的浓缩液。该浓缩液用乙酸乙酯以1∶1（v∶v）的比例液液萃取3次，得到除去脂溶性成分的花色苷样品。将粗提得到的花色苷样品过Amberlite XAD-7柱色谱进行粗分离（洗脱溶剂为含0.5%三氟乙酸的甲醇），除去色素混合物中含有的糖、酸等杂质。旋蒸除去甲醇，得到纯化后的花色苷。

1.2.2超声波处理以100W为梯度单位，设置200～500W四个功率梯度；同时以15min为梯度单位，设置15～90min六个时间梯度，分别取5mL花色苷样品进行超声波处理，得到处理后的24个样品。

1.2.3动力学分析参照Kırca和Cemerogˇlu［10］的方法，应用一级反应动力学模型分析超声波对矢车菊素的降解过程。

ln（Ct/C0）=-k×t

t1/2=-ln0.5×k-1

式中，Ct为处理后矢车菊素在时刻t的残留量；C0为未经处理的矢车菊素含量；k为一级反应动力学的速率常数；t1/2为矢车菊素的半数降解时间。

1.2.4清除羟自由基（·OH）能力的测定在试管中分别加入0.05%溴甲酚紫乙醇溶液0.4mL、0.1mol/L HCl 0.5mL、1.8mmol/L FeSO4溶液1.0mL，用重蒸水稀释至刻度，摇匀，置于30℃恒温水浴中反应8min，用比色皿，以水为参比，在420nm处测定溶液的吸光度，测定三次取平均值作为A0。同法，在加入1mmol/L FeSO4溶液后再加入0.1mol/L H2O20.5mL，测定溶液的吸光度，测定3次取平均值作为A，计算吸光度降低值（ΔA=A0-A）。

花色苷清除·OH的测定：先于试管中分别加入0.05%溴甲酚紫溶液0.4mL、0.1mol/L HCl 0.5mL、1.8mmol/L FeSO4溶液1.0mL、0.1mol/L H2O20.5mL，分别加入经过不同功率及时间处理过的样品，做三组平行实验，分别测定吸光度，取平均值作为AS。则花色苷实验组对·OH的清除率D为：

D（%）=（AS-A）/ΔA×100

1.2.5铁还原力测定参照孙建霞［11］的研究方法，配制TPTZ工作液，该工作液由2.5mL 10mmol/L的TPTZ溶液，25mL 0.3mol/L醋酸盐缓冲液，2.5mL 20mmol/L的FeCl3组成。将样品稀释10倍至40μL，和260μL TPTZ工作液反应30min后，测定其在593nm处的吸光值。样品的铁还原能力以相当于nmol/mL Trolox的铁还原能力表示。

Trolox标准曲线绘制：采用0.5%TFA水和甲醇（7∶3，v∶v）配制浓度为600、400、200、100、50、25nmol/L的Trolox标准溶液，分别取40μL与TPTZ工作液在相同条件下反应，测定吸光值，制作标准曲线。

1.2.6清除DPPH·能力的测定参照张燕［12］的研究方法，并稍作改进。将2.6mL 0.14mmol/L的DPPH·甲醇溶液和0.4mL样品混合后，常温避光条件下放置45min，在紫外分光光度计中517nm波长下测定其吸光值。设定以不加样品的DPPH·溶液为对照，清除DPPH·的能力以相当于nmol/mL Trolox清除DPPH·的能力表示。

Trolox标准曲线：采用0.5%TFA水和甲醇（7∶3，v∶v）配制浓度为600、400、200、100、50、25nmol/L的Trolox标准溶液，分别取40μL与DPPH·工作液在相同条件下反应，测定吸光值，制作标准曲线。

1.2.7在β-胡萝卜素-亚油酸体系中的作用准确称量5mg β-胡萝卜素，溶于10mL的氯仿中，再加入0.25mL的亚油酸和2.0mL的Tween-20，混合均匀后移入圆底瓶中，于50℃旋转蒸发4.0min，然后加入500mL蒸馏水备用，作为反应液；同时准确称取VC，配成0.5mg/mL的VC溶液作为对照；将不同处理后的桑葚花色苷样品稀释，作为待测液。向各试管中分别加入1.0mL不同的待测液和4.0mL反应液，于50℃水浴中反应，每隔25min测其在470nm处的吸光度A（分别在不同的待测液构成的体系中，以蒸馏水代替β-胡萝卜素作为空白调零），共测量150min，抗氧化能力按下列公式计算［13］：

抗氧化能力（%）=［1-（A0-At）/（A0’-At’）］×100

其中，A0和At分别为加入样品后0min和150min时的吸光度；A0’和At’分别为不加样品时0min和150min时的吸光度。

2　结果与讨论

2.1动力学分析

对花色苷降解过程进行动力学模型分析可用于预测加工过程花色苷降解速度，从而减少花色苷的损失，有利于控制食品的品质。根据文献报道［13-14］，诸多因素都会对花色苷稳定性产生影响，许多学者根据不同因素应用不同模型对花色苷降解过程进行了模拟，发现花色苷在不同的条件下，符合的降解动力学模型也不同，主要可分为零级、一级、二级和复杂反应动力学。孙建霞［11］发现高压脉冲电场（PEF）降解矢车菊素-3-葡萄糖基（Cy-3-glc）和矢车菊素-3-槐糖苷（Cy-3-soph）符合一级反应动力学。

图1　超声波降解矢车菊素的动力学分析Fig.1　Kinetics analysis of cyanidin after ultrasonic treatment

本实验超声波处理中功率、时间与矢车菊素的降解关系如图1所示，随着处理功率的增大和时间的延长，ln（Ct/C0）减小，矢车菊素的含量减少，即矢车菊素的保留率显著（p＜0.05）降低，表明矢车菊素发生了显著降解（p＜0.05）。超声波降解矢车菊素符合一级反应动力学（R2均在0.91以上）。超声波降解矢车菊素的动力学参数如表1所示。

表1　超声波降解矢车菊素的动力学参数Table 1　Kinetics parameters of Cyanidin degradation exposed to ultrasonic wave

由表1的动力学参数发现，200W时降解速率常数只有1.34×10-2min-1，半数降解时间为51.7274min，而当功率增大到500W时，降解速率常数迅速升至5.89× 10-2min-1，半数降解时间也急速降至11.7682min。

本实验中超声波对花色苷的影响主要为空化作用，空化作用产生高温、高压，促使水分子裂解为自由基，自由基由于含有未配对电子，性质非常活泼，具有强氧化性，进一步促进了花色苷的降解。水分子裂解为自由基需要很大的能量，较低功率状态下超声波脉冲的能量较小，因此产生的自由基比较少，从而矢车菊素保留率较高，降解速率较小。

2.2清除羟自由基（·OH）能力的测定

图2　·OH清除率与超声波功率、时间的关系Fig.2　The correlation between clearance rate of·OH and ultrasonic power and treatment time

由图2可以看出，相同功率的超声波条件下，随着超声时间的增长，矢车菊素清除·OH的能力逐渐下降，且功率越大，这种影响越强烈。如200W条件下清除自由基能力下降曲线十分平缓，而500W时则变化非常明显（p＜0.05），处理时间为90min时清除·OH的能力已经下降到7.8%，几乎已经失去了清除自由基的能力。当功率由200W增加至500W，处理时间由15min增长至90min时，样品对·OH的清除率平均下降40%。

虽然本实验中Fenton法会产生·OH，但是由于每一组工作液中产生的·OH的量相同，且在计算中已经扣除，因此对总趋势并不产生影响。

综上可以得到结论，超声波处理会使矢车菊素清除·OH的能力下降，且变弱程度与超声波功率及处理时间有一定相关性。产生这种现象的原因是超声波的空化作用使小分子裂解产生的·OH会对矢车菊素进行攻击，导致矢车菊素遭到破坏，丧失了清除自由基能力，因此清除·OH能力下降，超声波处理的强度越大，这种破坏就越严重。

2.3抗氧化活性分析

目前有很多方法可以评价体系的抗氧化能力，不同的方法也基于不同的原理，但是在评价一种复杂体系的抗氧化能力时，没有一种评价方法能够代替其他所有的方法并且做到全面而准确［15］。FRAP和DPPH两种方法具有快速、简便、灵敏和重复性好等优点［16］，而β-胡萝卜素-亚油酸法的优点是只使用少量的样品和试剂，重现性好，对脂溶性样品测定效果好［17］。所以，本实验结合了FRAP、DPPH和样品在β-胡萝卜素-亚油酸体系中的抗氧化作用三种方法来综合评价经过超声波处理降解花色苷后抗氧化活性的变化。

2.3.1FRAP、DPPH结果分析经超声波处理后矢车菊素溶液体系的FRAP和DPPH·活性变化如图5所示，其中（a）、（b）为铁还原能力测定结果，（c）、（d）为清除DPPH·自由基能力测定结果。

参照图5（a）、图5（b）两图，与对照相比，经过超声波处理后的矢车菊素溶液体系抗氧化活性均降低，在大功率、长时间作用下，这种趋势更加显著（p＜0.05）。当处理时间只有15min时，样品的铁还原力仅仅下降了5%～25%，而当时间延长至90min时，铁还原力最大下降了71.833%。而在同样的处理时间下，当超声波功率增大，铁还原力下降程度越大。当处理时间均为90min时，随功率由200W增大到500W，铁还原力下降程度由22.113%增加到71.833%，增加十分明显（p＜0.05）。由此可知，超声时间的延长以及超声功率的增大会导致矢车菊素降解程度加强。

参照图5（c）、图5（d）两图，与对照相比，经过超声波处理后的矢车菊素溶液体系抗氧化活性均呈降低趋势。当超声波处理功率一定时，随着处理时间的延长，清除DPPH·自由基能力下降越来越明显。如超声波处理功率在500W时，随着时间由15min延长至90min，样品清除DPPH·自由基能力下降程度从22.989%增大至38.604%，下降极显著（p＜0.01）。同时，在处理时间一定时，当超声功率增大，清除DPPH·自由基能力下降百分比变化极显著（p＜0.01）。如当处理时间均为90min时，随功率由200～500W，清除DPPH·自由基能力下降程度由21.611%增大到38.604%，下降较为明显。

图3　Trolox在593nm处标准曲线（FRAP）Fig.3　Correlation between Trolox content and the absorbance at 593nm（FRAP）

图4　Trolox在517nm处标准曲线（DPPH·）Fig.4　Correlation between Trolox content and the absorbance at 517nm（DPPH·）

图5　超声波处理对矢车菊素的FRAP（a，b）、DPPH·（c，d）抗氧化活性影响Fig.5　Effect of ultrasonic treatment on the the antioxidant activities of cyanidin measured by FRAP（a，b），DPPH·（c，d）

综上所述，由于超声时间的延长及功率增大，即长时间、高能量的作用，超声造成的空化作用加强，促使更多的水分子裂解，产生更多的性质活泼、具强氧化性的自由基，从而促进花色苷降解。由此得到结论，随着超声波处理时间的延长以及功率的增大，矢车菊素的抗氧化活性下降更加明显。

2.3.2在β-胡萝卜素-亚油酸体系中的抗氧化作用图6表明，处理功率与时间都会影响花青素的β-胡萝卜素抗氧化活性。随着处理时间的延长，抗氧化能力呈下降趋势，特别是200W功率下，下降趋势变化显著（p＜0.05）。同时超声波功率也会对体系中的抗氧化能力产生影响，功率越大，抗氧化能力越弱。超声波处理的功率和时间对抗氧化能力有相同的影响趋势，低功率和短时间抗氧化能力的影响都较小。而当功率一旦增大到300W，时间延长至60min时，抗氧化能力明显减弱（p＜0.05）。同时还发现，所有处理后的花青素溶液的抗氧化能力都要显著高于VC溶液（p＜0.05）。

Effects of ultrasonic wave treatment on stabilities of cyanidin from mulberry

MA Lin1，ZHAO Rui-jie1，LI Jing-yang1，JIA Yi-fan1，ZHANG Ya-jie1，CHEN Jian1，2，*
（1.Department of Food Science，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Forestry University，Key Laboratory of Forestry Food Processing and Security，Beijing 100083，China）

In order to investigate the influence of ultrasonic treatment in food processing for raw materials rich in anthocyanin，in this research，cyanidin from mulberry extracts were used as materials.The effects of ultrasonic waves on cyanidin stabilities and antioxidant activity were investigated.Further，the relation between the hydroxyl radical scavenging and anthocyanin degradation in ultrasonic treatment was analyzed.Experimental results showed that the ultrasonic treatment could lead to partial degradation of anthocyanins.With the intensity increasing，the stability of anthocyaninsin significantly reduced and antioxidant capacity was weakened.When the ultrasonic power was increased from 200W to 500W，processing time increased from 15min to 90min，the scavenging rate to·OH of the sample decreased by 40%on average and antioxidant activity decreased by 5%～70%.

ultrasonic waves；anthocyanin；cyanidin；stability；antioxidant activity；hydroxyl radicals

TS255.36

A

1002-0306（2015）12-0138-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.020

2014-08-29

马琳（1993-），女，大学本科，研究方向：天然产物的提取与利用。

陈健（1985-），男，讲师，研究方向：天然产物的提取与利用。

中央高校基本科研业务费专项资金资助（xs2014020）。