武汉地区黄瓜靶斑病病原鉴定及生物学特性研究

杨绍丽，吴仁锋，马晓龙，杨德枝

（武汉市蔬菜科学研究所，430065）

武汉地区黄瓜靶斑病病原鉴定及生物学特性研究

杨绍丽，吴仁锋，马晓龙，杨德枝

（武汉市蔬菜科学研究所，430065）

2011年7月在武汉黄陂发现黄瓜靶斑病，对病样进行分离、致病性测定、形态学鉴定，并对病原进行了生物学特性研究。结果表明，引起武汉地区黄瓜靶斑病的病原菌为多主棒孢霉（）。这是多主棒孢霉在武汉引起黄瓜靶斑病的首次报道。生物学特性研究结果表明，光照有利于病原菌菌丝生长；病原菌菌丝生长的适宜温度范围为25～30℃；最适宜pH值为6～9；病原菌能够利用多种碳源和氮源，碳源以麦芽糖利用效果最好，氮源以硝酸钾利用效果最好。

黄瓜；靶斑病；多主棒孢霉；生物学特性

1　材料与方法

1.1病样采集及症状观察

2011-2014年在武汉黄陂、蔡甸等蔬菜基地黄瓜上发现有疑似靶斑病症状，观察记录症状并拍照。

1.2病样的分离

采用常规组织分离法［11］：取病斑典型的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净，切取病健交界处的组织，先用0.1%升汞消毒1～2 min，再用75%酒精消毒1 min左右，最后用无菌水冲洗3次，每次1 min。消毒完成后，吸干组织表面水分，再将可能被杀死的组织剪去，剪成小块，每皿3～5块，接在PDA平板上，置于25℃恒温箱中培养。菌落形成后，选典型菌落转接3次，进行纯化，4℃保存备用。

1.3致病性测定

1.4病原菌形态学鉴定

通过柯赫氏法则验证，确定引起黄瓜靶斑病的病原。将供试菌株接种到PDA平板上，25℃培养箱暗培养，测量菌落生长直径，描述菌落颜色、形态，挑取培养物，用显微镜观察分生孢子器、分生孢子形态，测量其大小。

1.5病原菌生物学特性

①光照对病原菌菌丝生长的影响在活化培养7 d的菌落边缘，打取直径6 mm的菌饼，接种于PDA平板中央。将接菌后培养皿置于 25℃HP250GS智能型人工气候培养箱恒温培养。设置连续黑暗、12 h光暗交替、连续光照3个处理，每个处理3个重复，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

②不同温度对病原菌菌丝生长的影响在活化培养7 d的菌落边缘，打取直径6 mm的菌饼，接种于PDA平板中央，将接菌后的培养皿分别置于5、10、15、20、25、30、35、40℃恒温箱中培养，每个处理3个重复，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

③不同pH值对病原菌菌丝生长的影响将PDA培养基的pH值分别调节为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，制成不同pH值的平板，在平板中央接种6 mm的新鲜菌饼，3个重复，25℃恒温暗培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

④不同碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响以查氏培养基［11］为基础培养基。用含碳量相同的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、可溶性淀粉代替其中的蔗糖。用含氮量相同的尿素、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、精氨酸代替其中的硝酸钾。在活化培养7 d的菌落边缘，打取直径为6 mm的菌饼，接种在不同碳、氮源平板中央，3个重复，置于25℃恒温箱培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

2　结果与分析

2.1黄瓜靶斑病田间症状及病原菌的分离培养

2011年7月在武汉黄陂武湖黄瓜展示田，发现黄瓜中下部叶片出现疑似靶斑病的症状。叶片发病初期为黄色水浸状斑点、稍凹陷。发病中期病斑扩大为近圆形、圆形或不规则形，灰白色，在圆形或近圆形病斑中央常会有淡黄色的小斑点（图1A）。中后期多个病斑常连成片。该病常与霜霉病、细菌性角斑病混合发生，易与细菌性角斑病混淆。

陆九渊，字子静，南宋初年人，生于公元1139年，逝于公元1193年。他曾讲学于江西象山书院，世人称之为象山先生。陆九渊以其心学思想传名于世，这种思想曾在南宋与朱熹的理学思想分庭抗礼，并在明代被王阳明发扬光大，成为中国传统精神世界中不可忽视的一股力量。陆九渊的心学理论在今天的中国社会中仍然发挥着一定的作用。

图1　黄瓜叶片接种15 d后发病症状

2011-2014年每年从发病严重的田块，采集疑似靶斑病病样标本，对8份样品进行分离，均能分离出棒孢霉属（sp.）真菌且形态一致。以2011年分离菌株HPbb为典型菌株进行鉴定，本文中涉及到病原菌的所有试验，使用的均为该菌株。

2.2致病性测定

配制103～104个/mL的分生孢子悬浮液喷雾接种于20株2片真叶期黄瓜幼苗，结果表明，植株的发病率为100%。接种3 d后，零星有叶片出现水浸状病斑，7 d后出现典型病斑，同田间发病症状（图1A）一致，对照无症状（图1B）。从发病叶片再次分离，获得培养性状和形态特征与接种菌一致的分离物。

2.3病原菌形态学鉴定

分离物在PDA培养基上暗培养，菌落平、致密，呈辐射状展开，边缘规则，气生菌丝绒毛状，颜色为灰色、褐色至灰黑色，5 d后菌落平均直径46.7 mm（图2A）。菌丝淡褐色，有隔膜，分枝。分生孢子梗淡褐色、直或弯曲、不分枝、具隔膜，分生孢子梗有层出现象，大小多为（90～210）μm×（3～5）μm。分生孢子浅褐色，壁平滑，倒棍棒形，顶端钝圆，直或弯曲，具有假隔膜2～9个，大小（20～195.5）μm×（5～10）μm（图2B），孢子幼时单生或串生（图2C）。

通过对PDA培养基上的培养形态、菌丝、分生孢子、分生孢子梗等形态的描述，这些特征与其他文献［5，9，10，12～15］报道的关于黄瓜靶斑病多主棒孢菌的描述基本一致，确定引起武汉地区黄瓜靶斑病的病原为多主棒孢霉（）。

2.4病原菌生物学特性研究

①光照条件对病原菌菌丝生长的影响由图3可以看出，在连续黑暗、12 h光暗交替、连续光照3种条件下，病原菌在PDA平板上培养5 d后，连续光照条件下菌落平均直径最大，达50.67 mm，说明光照对菌丝生长有促进作用。

②温度对病原菌菌丝生长的影响由图4结果可以看出，不同温度下生长5 d，病原菌菌落直径差异显著，说明温度对病菌的生长影响很大。病原菌在10～35℃均能生长，菌丝生长最适温度为25～30℃；30℃时，5 d菌落直径最大，达51.0 mm；5℃以下及温度达到40℃时，菌丝停止生长。

图2　病原菌的形态特征

图3　光照对病原菌菌丝生长的影响（5 d）

图4　不同温度对病原菌菌丝生长的影响（5 d）

图5　不同pH值对病原菌菌丝生长的影响（5 d）

③pH值对病原菌菌丝生长的影响由图5可以看出，PDA平板上，病原菌菌丝在pH值3～12时均可生长，适宜生长的pH值为6～9；其中pH值为8时菌丝生长最快，5 d后菌落平均直径51.83 mm。说明该菌最适合在中性偏碱条件下生长。

④碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响由表1可以看出，病原菌能够利用多种碳源和氮源，其中以麦芽糖作碳源最有利于菌丝生长，5 d后菌落直径达到47.17 mm，其次是乳糖，可溶性淀粉最差；以硝酸钾作氮源最利于菌丝生长，5 d后菌落直径达到39.83 mm，氯化铵利用效果最差。

表1　不同碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响（5 d）

3　讨论与结论

经病原菌的分离培养、形态学鉴定以及致病性测定，引起武汉地区黄瓜靶斑病的病原为，为半知菌亚门多主棒孢霉，该病原形态与前人研究［3～5，9，14，15］描述的黄瓜靶斑病（褐斑病）病原形态基本一致。对病原菌生物学特性研究表明，黄瓜靶斑病菌在10～35℃下均能生长，最适温度为30℃，与前人研究［2，5，15，16］报道的基本一致；光照能促进菌丝生长，与刘鸣韬等［16］的报道一致；本研究中最适宜病原菌菌丝生长的pH值为6～9，与邹庆道等［15］的研究结果基本一致，而李长松等［5］的研究结果中菌丝生长最适宜pH值为5～8，说明黄瓜靶斑病菌菌丝生长在不同地区对pH值的要求不同。本研究中病原菌能够利用多种碳、氮源，碳源以麦芽糖和乳糖效果最好，与刘鸣韬等［16］研究结果基本一致；在氮源利用上，以硝酸钾作氮源最有利于菌丝生长。以上研究结果表明，引起武汉地区黄瓜靶斑病的病原多主棒孢霉是一种耐高温、最适宜中性弱碱环境生长并能够利用多种碳氮源的病原真菌。本研究结果为今后了解多主棒孢霉的侵染和靶斑病病害流行奠定了基础，对其他因子以及分生孢子的生物学特性有待进一步研究。

［1］戚佩坤，白金锴，朱桂香，等.吉林省栽培植物真菌病害志［M］.北京：科学出版社，1960：479-480.

［2］房德纯，傅俊范.黄瓜褐斑病病原与发病情况调查研究初报［J］.植物保护，1994（3）：23-24.

［3］刘鸣韬，徐瑞富，蒋学杰，等.黄瓜靶斑病研究初报［J］.河南农业科学，2003（8）：33-35.

［4］李宝聚，赵彦杰，于淑晶，等.李宝聚博士诊病手记（六）——2008年秋季河北青县黄瓜棒孢叶斑病大发生［J］.中国蔬菜，2008（11）：51-52.

［5］李长松，张眉，李林，等.山东省黄瓜棒孢叶斑病（褐斑病）病原菌鉴定和防治［J］.中国蔬菜，2009（18）：29-33.

［6］查仙芳，朱猛蒙，王国珍，等.宁夏首次发现黄瓜靶斑病［J］.宁夏农业科技，2009（2）：40.

［7］岳宏忠.黄瓜褐斑病的识别与防治［J］.甘肃农业科技，2010（2）：50-51.

［8］李月荣.黄瓜褐斑病的识别与防治［J］.现代农业科技，2010（11）：177.

［9］曾蓉，陆金萍，戴富明.上海地区黄瓜靶斑病病原鉴定及ITS的分析［J］.上海交通大学学报：农业科学版，2011，29（4）：13-16.

［10］蓝国兵，谭耀华，何自福，等.黄瓜褐斑病（）在广东首次报道［J］.植物保护，2012，38（5）：197-200.

［11］方中达.植病研究方法.3版［M］.北京：中国农业出版社，1998.

［12］高苇，李宝聚，石延霞，等.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化［J］.园艺学报，2011，38（3）：465-470.

［13］王承海.中国棒孢菌属分类研究［D］.泰安：山东农业大学，2006.

［14］杨苗.我国蔬菜棒孢叶斑病病原菌多样性研究［D］.北京：中国农业科学院，2013.

［15］邹庆道，傅俊范，朱勇，等.黄瓜褐斑病病原菌鉴定及生物学特性研究［J］.沈阳农业大学学报，2002，33（4）：258-261.

［16］刘鸣韬，张定法，孙化田.黄瓜靶斑病菌的生物学特性［J］.中国蔬菜，2003（4）：17-18.

Identification and Biological Characteristics of Pathogen of Cucumber Target Spot Caused by Corynespora cassiicola

YANG Shaoli，WU Renfeng，MA Xiaolong，YANG Dezhi

Cucumber target spot disease was observed in Huangpi of Wuhan in July 2011，then we studied the morphological characteristics，pathogenicity and biological characteristics of the isolated pathogen.The results showed that，the cucumber target spot was caused by，and the paper was the first report of the disease caused byin Wuhan.The biological characteristics of the pathogen showed that，illumination promoted the mycelial growth，and the optimum temperature and pH value were 25-30℃ and 6-9 for the mycelial growth.The pathogen could make use of various carbon and nitrogen sources，and maltose and potassium nitrate were best carbon source and nitrogen source for mycelial growth respectively.

Cucumber；Target spot；；Bio1ogical characteristics

S436.421

A

1001-3547（2015）04-0058-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.04.021

武汉市农科院科技创新项目［武农科政（2014）5号］

杨绍丽，女，农艺师，研究方向蔬菜病害诊断及综合防控，E-mail：yangshaoli0123@163.com

吴仁锋，男，通信作者，高级农艺师，主要从事蔬菜病害诊断及综合防控方面的研究，E-mail：wuhanwurenfeng@126.com

2014-12-23