膀胱癌组织中肺癌肿瘤抑制物1基因启动子甲基化状态和蛋白表达及其临床意义*

杨永姣 ，刘莉 ，陈业刚 ，王尚任 ，刘晓强 ，陈少峰 ，孙光

（1.天津医科大学第二医院 泌尿外科，天津 300211；2.天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

肺癌肿瘤抑制物1（tumor suppressor in lung cancer1，TSLC1），又称细胞黏附分子 1（cell adhesion molecule1，CADM1），是 2001年由 KURAMOCHI等[1]在人类非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）中发现的一种抑癌基因，定位于染色体11q23.2，翻译生成442个氨基酸残基的跨膜糖蛋白。大量研究显示，TSLC1在一系列人类肿瘤组织和细胞系中呈低表达或缺失，包括食管癌[2]、黑色素瘤[3]、肝癌[4]、卵巢癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、喉鳞癌[8]、结肠癌等[9]，其低表达与启动子区CpG岛甲基化相关[6，10]。本课题前期研究发现，膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1蛋白表达降低，与病理分级呈负相关[11]。本研究采用甲基化特异性PCR（MSP）检测84例膀胱尿路上皮癌组织和20例正常膀胱黏膜组织中TSLC1基因启动子CpG岛甲基化状态，WB检测TSLC1蛋白的表达，以探讨TSLC1基因启动子区CpG岛甲基化状态和蛋白表达的关系及其意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年3月-2014年4月在天津医科大学第二医院泌尿外科行手术治疗的84例膀胱尿路上皮癌患者的癌组织，病理结果均为尿路上皮癌；同时收集同期住院的20例良性前列腺增生患者的正常膀胱黏膜组织，病理结果均为正常膀胱黏膜。84例膀胱尿路上皮癌患者中，男性58例，女性26例；年龄48～82岁，中位数年龄66岁，其中年龄≤65岁33例，＞65岁51例；单发肿瘤34例，多发肿瘤50例；肿瘤直径≤3 cm 49例，＞3 cm 35例；复发性肿瘤49例，原发性肿瘤35例；病理分级低级别57例，高级别27例；肿瘤分期Ta、Tis及T150例，T2～T434例。所有标本均于术后0.5 h内获得，液氮速冻后置入-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒、DNA修饰试剂盒购自Omega公司，甲基化转移酶购自Solarbio公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，组织蛋白提取试剂盒购自博士德生物，鼠抗人TSLC1单克隆抗体购自Abnova公司，二抗羊抗鼠单克隆抗体、GAPDH内参抗体及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自康为世纪。

1.3 实验方法

1.3.1 TSLC1基因启动子CpG岛甲基化检测 采用E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit试剂盒提取基因组DNA，每个样本取30 mg左右的组织至加有200μl Buffer TL的离心管中，剪碎后匀浆处理，加入25μl OB蛋白酶，混匀，55℃水浴至组织完全消化，室温10 000×g离心5 min去除杂质，将上清液转移至另一离心管，加入220μl Buffer BL涡旋混匀，70℃水浴10 min，加入220μl的无水乙醇，高速涡旋15 s混匀，转移混合液至套有收集管的HiBind DNA柱子中，室温下8 000×g离心1 min，弃去滤液，把柱子装在新收集管中，加入 500μl HB Buffer，室温8 000×g离心1 min，弃去滤液，把柱子装在新收集管，加入 700μl DNA Wash Buffer，室温 8 000×g离心1 min，弃去滤液，把柱子重新装回收集管，12 000×g离心空柱2 min以甩干柱子基质，把柱子装在干净的1.5 ml离心管上，加入200μl 70℃预热的Elution Buffer到柱子基质上，室温下静置3 min后室温10 000×g离心1 min以洗脱DNA，保留含DNA的洗脱液。在UV3000紫外分光光度仪上测定吸光度值鉴定DNA纯度，OD260/OD280比值在1.8～2.0。甲基化特异性PCR（MSP）：用修饰试剂盒EZ DNA Methylation-Gold KitTM取1μgDNA进行修饰，在PCR管中添加130μl CT Conversion Reagent到每20μl DNA样品中（如果DNA样品的体积＜20μl，则用水来弥补差量），98℃放置10 min，64℃放置2.5 h，添加 600μl M-Binding Buffer到 Zymo-Spin ICTM Column中，并将柱放入Collection Tube中，装填样品到含有M-Binding Buffer的Zymo-Spin ICTM Column 中，混匀，全速（≥10 000×g）离心 30 s，弃去滤液，添加200μl M-Wash Buffer到柱中，全速离心30 s，添加200μl M-Desulphonation Buffer到柱中并且室温下放置20 min，全速离心30 s，添加200μl M-Wash Buffer到柱中，全速离心30 s，添加10μl的M-Elution Buffer到柱基质中，将柱放置在1.5 ml的管中，全速离心来洗脱DNA。取修饰好的DNA 4μl进行MSP反应。TSLC1基因甲基化引物M，正向引物：5'-TTTTAATTATTATTTTCGAGTTTATC G-3'，反向引物：5'-TCTTTAAAAACGAAAACTATAC G-3'；非甲基化引物U，正向引物：5'-TTTTTTAATTA TTTTTGAGTTTATTG-3'，反向引物：5'-AAATCTTTA AAAACAAAAACTATAC-3'。反应体系参照PCR试剂盒推荐量50μl：PCR混合液25μl，上下游引物各2μl，模板 4μl，无核酶水 17μl。MSP 循环条件：95℃预变性 10 min，94℃变性 30 s，57℃（甲基化引物）或55℃（非甲基化引物）退火30 s，72℃延伸60 s，共35个循环，72℃继续延伸5 min。为保证检测结果的可靠性，以经甲基转移酶（M SssI）和未经M SssI处理的正常人外周血淋巴细胞DNA分别作阳性和阴性对照组。取PCR产物10μl行2%琼脂糖凝胶电泳，110 V电泳40 min，凝胶成像系统下照相。结果判定标准：只要应用甲基化引物扩增出特异性条带即可认为存在甲基化（M），只有应用非甲基化引物扩增出特异性条带方可认为不存在甲基化（U）。

1.3.2 Western blot检测膀胱癌组织和膀胱正常黏膜组织中TSLC1蛋白的表达水平 按照组织净重（mg）∶裂解液（μl）=1∶10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，冰上孵育2 h，直至充分裂解、离心后取少量上清液，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书绘制标准曲线并检测样本蛋白浓度，制备SDS-PAGE凝胶，计算取出20μg蛋白经沸水煮5min后上样，设置电压为80 V，电泳1.5 h；把电泳分离的样品从凝胶转移到固相载体PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗鼠抗人TSLC1单克隆抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜、二抗羊抗鼠单克隆抗体（1∶5 000）孵育2 h，以鼠抗人GAPDH作为内参。ECL化学发光试剂加在PCDF膜上反应5 min，凝胶成像分析系统下显影、定影。利用Image-Pro Plus 5.0软件对蛋白表达的灰度值进行分析，蛋白相对表达为目的基因与内参基因的比值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，膀胱癌患者组及其对照组中TSLC1基因启动子区CpG岛甲基化状态的比较用Fisher’s确切概率法，膀胱癌患者中TSLC1基因启动子甲基化与临床病理特征的关系用四格表χ2检验，膀胱癌组和正常组TSLC1蛋白表达的比较用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TSLC1基因启动子区CpG岛甲基化状态及其与临床病理特征的关系

图1 膀胱癌组织中TSLC1基因启动子甲基化状态

附表 TSLC1基因启动子甲基化与膀胱癌临床病理特征的关系 例（%）

续附表

MSP结果显示，20例正常膀胱黏膜组织中未检测到TSLC1基因启动子甲基化；84例膀胱尿路上皮癌组织中43例检测到TSLC1启动子区CpG岛甲基化（见图 1），甲基化率为 51.2%（43/84），表明膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1基因启动子甲基化率明显高于正常膀胱黏膜组织，TSLC1基因启动子甲基化与膀胱癌的发生有关。膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1基因启动子甲基化与患者的性别、年龄、肿瘤数目无关（P＞0.05），而与肿瘤是否复发、肿瘤直径病理分级和临床分期有关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见附表。

2.2 TSLC1蛋白表达及TSLC1基因启动子甲基化与蛋白表达的关系

图2 膀胱癌组织中TSLC1蛋白的表达

Western blot检测结果表明，84例膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1蛋白的表达水平为（0.2613±0.1405），明显低于20例膀胱正常黏膜组织[（0.695 7±0.092 4）（t=7.457，P＜0.01）]（见图2）。43例发生TSLC1基因启动子甲基化的膀胱癌组织TSLC1蛋白表达水平为（0.114 3±0.044 3），明显低于41例未发生TSLC1基因启动子甲基化[（0.3756±0.0439）]（t=11.763，P＜0.01）。

3 讨论

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，其发生、发展是一个多因素相互作用的复杂过程，既有内在遗传因素，又有外在环境因素。虽然近年来膀胱癌的诊治取得一些进展，但仍未能十分有效地阻止疾病的进展和改善患者的预后，因此有必要对其发生、发展的相关因素进行深入研究。DNA甲基化是一种表观遗传修饰，该修饰影响着DNA和其他分子的相互作用，并且通过细胞分裂和增殖遗传，在胚胎的早期发育、干细胞的分化和特定的基因表达中起重要作用[12]。近年来，DNA甲基化研究成为肿瘤学研究的一个热点。

TSLC1是一种在NSCLC中发现的肿瘤抑制基因，TSLC1可通过抑制增殖和促进凋亡来抑制肿瘤的生长，并可介导同种或异种细胞间的相互黏附，在抑制上皮组织来源的恶性肿瘤中起重要作用[13]，TSLC1功能丧失可导致癌细胞浸润及转移[14]，一系列人类肿瘤组织和细胞系中TSLC1呈低表达或缺失，且其低表达与启动子区CpG岛甲基化相关[2-9，15-16]。TSLC1基因启动子甲基化可以作为一种肿瘤诊断、检测和预后判断的分子标记物。同时有研究发现，去甲基化药物天花粉蛋白处理宫颈癌HeLa细胞后可逆转TSLC1基因甲基化状态，从而诱导其重新表达发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用[17]。本实验应用MSP同时检测20例膀胱正常黏膜组织和84例膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1基因启动子甲基化状态，发现51.2%（43/84）的膀胱尿路上皮癌组织中存在TSLC1基因甲基化，而在20例正常膀胱黏膜组织中未检测到TSLC1基因甲基化，提示TSLC1基因启动子甲基化有肿瘤特异性，有望作为膀胱尿路上皮癌的诊断标记物。

本实验将TSLC1基因启动子甲基化状态与患者的临床资料进行分析后发现，原发性肿瘤中TSLC1基因甲基化率为37.1%，复发性肿瘤中甲基化率为67.3%；直径≤3 cm的肿瘤中甲基化率为42.9%，直径＞3 cm的肿瘤中甲基化率为68.6%；低级别肿瘤中甲基化率为43.9%，高级别肿瘤中甲基化率为74.1%；非肌层浸润性膀胱癌中甲基化率为44.0%，肌层浸润性膀胱癌中甲基化率为76.5%，差异有统计学意义（P＜0.05）。该结果提示TSLC1基因启动子甲基化与膀胱尿路上皮癌的大小、是否复发、分化程度和浸润深度等肿瘤的生物学行为有关。

本研究发现在84例膀胱尿路上皮癌组织和20例膀胱正常黏膜组织中，膀胱癌组织中TSLC1蛋白的表达水平明显低于正常组织；43例发生TSLC1基因启动子甲基化的膀胱癌组织TSLC1蛋白表达水平明显低于41例未发生TSLC1基因启动子甲基化的膀胱癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05），研究结果与前期研究发现膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1蛋白表达降低相符[11]。结果提示TSLC1基因启动子CpG岛甲基化可能是导致其蛋白表达下调的主要原因之一。

本研究结果表明，在膀胱尿路上皮癌组织中，TSLC1基因具有较高的甲基化率，并且与膀胱癌的发生、发展密切相关。因此有必要进一步研究TSLC1在膀胱癌中的功能及其可能机制，为膀胱癌早期诊断、判断预后及基因治疗提供新的理想靶点奠定研究基础。

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