蝙蝠葛活性成分抑制胃癌SGC-7901细胞转移侵袭作用*

张淼　李默　丁宁

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040）

·研究报告·

蝙蝠葛活性成分抑制胃癌SGC-7901细胞转移侵袭作用*

张淼1李默1丁宁2△

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040）

目的探讨蝙蝠葛活性成分对人胃癌SGC-7901细胞的运动能力及其机制。方法采用划痕试验、transwell迁移实验、transwell侵袭实验观察蝙蝠葛活性成分对人胃癌SGC-7901细胞的运动能力、降低SGC-7901细胞转移侵袭作用的影响。结果与对照组相比较，蝙蝠葛活性成分处理之后，细胞修复该划痕的能力减低。蝙蝠葛活性成分作用之后人胃癌SGC-7901细胞通过聚碳酸酯膜的迁移运动能力下降，并且与对照组相比其差异具有统计学意义（P＜0.05）。蝙蝠葛活性成分作用之后，人胃癌SGC-7901细胞通过涂抹matrigel胶的聚碳酸酯膜的能力下降，并且与对照组相比其差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论蝙蝠葛活性成分能够抑制胃癌SG07901细胞的运动能力、迁移能力以及侵袭能力。

蝙蝠葛生物活性胃癌SGC-7901细胞转移侵袭

胃癌属于首位消化道恶性肿瘤病症，在治疗中虽然外科手术等治疗手段取得了较大的进步，然而在生存率方面并不是非常显著，患者的5年存活率仍然较低［1］。由于胃癌的转移性较高，因此在治疗中不仅需要对病灶区域进行治疗，还需要对肿瘤细胞的转移进行控制和治疗。本次研究通过划痕试验，transwell迁移实验以及transwell侵袭实验观察了蝙蝠葛活性成分对人胃癌SGC-7901细胞的运动能力影响，研究通过降低SGC-7901细胞转移侵袭作用的可能机制，以期为临床治疗胃癌防止其转移提供一定的参考。现报告如下。

1　材料与方法

1.1药物与试剂蝙蝠葛活性成分（中国医学科学院昆明植物研究所提供）。人胃癌SGC-7901细胞株（美国模式培养物保藏所提供）。细胞培养液的配制：RPMI Medium 1640（Gibco公司提供）；新生胎牛血清（Fetal calf serum，FCS，Gibco公司提供）；胰蛋白酶（Tripsin）；PBS缓冲液（pH：7.2～7.4，Gibco公司提供）、二甲基亚砜（DMSO）；Matrigel胶；单克隆抗体MMP-2和NM23；十二烷基硫酸钠（SDS），N，N-亚甲双丙烯酰胺，TEMED，丙烯酰胺，过硫酸铵（APS），甘氨酸，巯基乙醇，溴酚兰，脱脂奶粉，甘油，PVDF膜，考马斯亮蓝，泛-actin。

1.2仪器超净工作台；37℃恒温CO2细胞培养箱；离心机；电热干燥箱；电子天平；倒置显微镜；载波片和盖玻片；制冰机；磁力搅拌器；微量加样器（1000、200、100、20、10 μL）；摇床恒温水浴锅；96孔培养板，24孔培养板，6孔培养板；光学显微镜；transwell小室；全波长酶标仪；SDS-PAGE电泳仪；转膜仪。

1.3实验方法

1.3.1划痕试验利用胰蛋白酶来对人胃癌进行消化，吹打SGC-7901细胞的细胞悬液浓度为5×104个/mL，同时利用均匀的直尺放置在6孔板的后面，用笔画出横线，每个孔都画出4条一样的横线，在实验组和对照组的细胞中放入6孔板，然后再一起放置在37℃，5% CO2的细胞培养箱中进行培养，第2天开始使用10 μL的无菌枪头再画出横线，用无菌PBS洗涤3次，去除划痕下的残留细胞并加入无血清的培养液之中，同样要放置在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，从培养开始分别于0、24 h后对其进行拍照，记录下培养结果，此次试验需要重复操作3次。

1.3.2transwell迁移实验1）取出生长期对数的SGC-7901细胞，利用胰酶的作用将其消化制作出浓度为5×104个/mL的细胞悬液，最后将其放置在100 mL的培养瓶中继续培养，直至细胞紧贴瓶壁后方可加入蝙蝠的葛活性成分进行处理，其最终的质量浓度分别为2.3，4.9，9.8 μg/mL，将实验组分为1、2、3组别，再从对照组中加入相同容量的药物溶剂放置培养箱中培养48 h。2）使用孔径为8 μm聚碳酯膜中的transwell小室24孔板；3）细胞悬液的制作：用胰蛋白对细胞进行消化，停止消化后便可以进行离心试验，然后使用PBS对其进行2次洗涤，用无血清的培养基来对细胞进行重悬，将其的密度调整为5×105；4）进行细胞接种的时候首先取出200 W的细胞悬液加入至transwell小室之中，然后再从24孔板下室加入600 μL含有20%的胎牛血清RPMI1640培养液；5）上述步骤完成后再将24孔板放置在培养箱中培养24 h，24 h后取出上室，使用棉签将上室内的细胞擦去；6）将500 μL含0.5 mg/mL MTT的完全培养基加入到24孔板之中，同时置入小室，使得膜能够浸没在整个培养基内，温度为37℃，放入培养箱后于4 h后即可取出；7）最后加入至500 μL的DMS0，使德膜完全浸没在DMSO里，为让甲臜在培养基中充分溶解振荡20 min左右，然后取出小室，利用酶标仪对OD值进行测量。

1.3.3transwell侵袭实验本步骤与上述transwell迁移实验的实验步骤基本一致，其中的区别在于本次实验需要铺设matrigel胶。1）融化matrigel基底胶液，用实验枪头吸取出约100 μL的matrigel液，将其加入至预冷无血清培养基中，充分搅匀，使用50 μL matrigel液将其加入至包被人工基底膜，将整个聚碳酯膜进行合理覆盖，在4℃下进行风干，使其最终成为matrigel聚合成胶。2）把铺设好基底膜的transwell放置入无菌的超净台之中，基底膜主要作用为吸出培养基中所剩余的液体，用紫外线对其进行消毒并过夜；3）每个孔内加入50 μL的无血清培养液，对其观察有无出现渗漏的现象，没有渗漏则使用于侵袭的实验当中，并在37℃的温度条件下放置1 h，最后将残余液体吸走，尽量不要触碰到膜；4）细胞悬液的制作要用胰蛋白对细胞进行消化，停止消化后便可以进行离心试验，然后使用PBS对其进行2次洗涤，用无血清的培养基来对细胞进行重悬，将其的密度调整为5×105/mL；5）进行细胞接种的时候首先取出200 W的细胞悬液加入至transwell小室，加600 μL含有20%的胎牛血清RPMI 1640培养液进入24孔板下室，去除完气泡后再将小室放入培养基中进行培养；6）上述步骤完成后再将24孔板放置在培养箱中培养24 h，24 h后取出上室，使用棉签将上室内的细胞和基质胶擦去；7）将500 μL含0.5 mg/mL MTT的完全培养基加入到24孔板之中，同时置入小室，使得膜能够浸没在整个培养基内，温度为37℃，放入培养箱后于4 h后即可取出；8）最后加入至500 μL的DMSO，使膜完全浸没在DMSO里，振荡20 min，使甲臜在培养基中充分溶解，取出小室，在酶标仪上测量OD值。

1.4统计学处理采用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，并对数据采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1划痕结果分析本次实验结果表明，经过蝙蝠葛活性成分的处理之后，与对照组相比较之下，其细胞对于划痕的修复能力有所降低，说明该成分会抑制胃癌细胞的运动能力。

表1　蝙蝠葛活性成分对胃癌SGC-7901细胞体外迁移能力的影响

2.2tran swell迁移试验结果见表1。结果示加入蝙蝠葛活性成分后，胃癌SGC-7901细胞通过聚碳酸酯膜时移动能力有所降低（P＜0.05），同时蝙蝠葛活性成分的浓度越高，其抑制效果就越强。2.3tran swell侵袭实验结果见表2。结果示人胃癌SGC-7901细胞在蝙蝠葛活性成分的作用之下，通过涂抹上matrigel胶的聚碳酸酯膜时，其移动的能力也有所降低，其差异和对照组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。研究结果表明，蝙蝠葛活性成分的浓度越高，所产生出来的细胞抑制作用就越强，因此说明，蝙蝠葛活性成分可以有效抑制胃癌SGC-7901细胞的运动能力，同时能够抑制胃癌细胞对人体的侵袭能力。

表2　蝙蝠葛活性成分对胃癌SGC-7901细胞体外侵袭能力的影响

3　讨论

肿瘤细胞的转移主要指的是其恶性的肿瘤细胞在人体的原发部位侵袭至淋巴管之中，或者是体腔、血管等部位，而转移到靶器官时，则会生长出与原发肿瘤组织学类型相同的肿瘤细胞［1］。肿瘤细胞在人体内的侵袭和转移过程非常复杂，它的转移步骤包括原发部位的肿瘤无限制性细胞的增殖，增殖后的肿瘤细胞从原发部位中脱离出去，然后浸润在基底膜内，透过细胞外基质及血管基底膜，从而在血管之中慢慢游走最后进入到人体血液循环以及淋巴血管中—逃过免疫细胞的抵抗—附着于血管的内皮细胞之中—缓慢透过血管内皮细胞—再进一步地转移至目标脏器之中进行增殖，转而形成另外一个病灶［2］。癌细胞的转移过程都需要进行失控性的增殖、侵袭、运动、黏附和血管生成等，本次实验研究发现，蝙蝠葛活性的成分对于人胃癌中的细胞作用后会使得其通过聚碳酸酯膜的数量减少，也会让其运动能力降低，有效抑制癌细胞的转移形成新病灶［3］。

近年来，关于上皮源性肿瘤和Nm23基因的关系研究非常多，许多的恶性肿瘤细胞主要有黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等，这些细胞组织中Nm23阳性表达率显著下降，说明Nm23参与肿瘤细胞的发展过程。截止到目前，我国在人胃癌中发现了9个Nm23基因家族成员，其中，Nm23-H1和肿瘤细胞转移受抑制有着极为密切的关系［4］。Nm23-H1的转移机制尚未明确，它只是中对肿瘤细胞的行为在多个层次有着一定影响，被公认的机制Nm23-Hl表达式中由152个氨基酸组成，它通过不同途径参与细胞调节过程，干预G蛋白所产生的信号传导行为［5］。在一定程度上促进了肿瘤细胞在体内的扩散。同时，它还会影响细胞的骨架结构从而抑制其运动能力［6］。

综上所述，蝙蝠葛活性成分对于人胃癌中的SGC-7901细胞运动能力、侵袭能力、失控性生长等有着相当重要的作用，它参与了肿瘤细胞的整个运动过程，蝙蝠葛活性成分抑制细胞基因增殖，加强了Nm23的基因抑制作用［7］。因此，我们可以认为蝙蝠葛活性成分有着非常重要的控制胃癌细胞侵袭及转移力的作用，具有非常大的开发价值及利用价值［8］。本次研究仅探讨出了肿瘤细胞相关发展过程，其他的细节及体内的侵袭转移过程是否也保持一样的抑制性，目前机制还未清楚，需要进一步研究。

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The Effect of Dauricum Active Ingredient on Inhibition of Invasion and Metastasis of SGC-7901 Cell in Gastric Cancer

Gastric Cancer
ZHANG Miao，LI Mo，DING Ning.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China

Objective：To investigate the dauricum active ingredient on the movement ability of SGC-7901 cells in human gastric cancer and its mechanism.Methods：scratch test，ransweII migration assay，transweII invasion experiment were used to observe dauricum active ingredient inhibit the abilities of the movement，migration and invasion of SG07901 cells in gastric cancer.Results：Compared with the control group，after dauricum active ingredient processing，the capacity of the cell to repair scratches reduced.Compared with the control group，dauricum active ingredients made the migration capacity of SGC-7901 cell through polycarbonate membrane decrease，with statistical significance（P＜0.05）.Compared with the control group，dauricum active ingredients made the migration capacity of SGC-7901 cell through polycarbonate membrane with matrigel decrease，with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：Dauricum active ingredient can inhibit the abilities of the movement，migration and invasion of SG07901 cells in gastric cancer.

Menispermum dauricum；Biological activities；Gastric cancer；SGC-7901；Cell invasion and metastasis

R730.59

A

1004-745X（2015）11-1908-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.009

2015-06-04）

黑龙江省自然科学基金面上资助项目（H201319）；黑龙江省博士后资助项目（LBH-Z12253）

（电子邮箱：13845088833@139.com）