谷氨酰胺对饥饿小鼠小肠乳脂肪球上皮生长因子E8表达的影响

张利娟　王颖　夏立亮　吴标　朱莎莎　杜隽铭★

谷氨酰胺对饥饿小鼠小肠乳脂肪球上皮生长因子E8表达的影响

张利娟王颖夏立亮吴标朱莎莎杜隽铭★

目的 观察谷氨酰胺对饥饿小鼠小肠乳脂肪球上皮生长因子E8（MFG-E8）表达的影响。方法 将25只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组（NC组，n=5），全饥饿组（S组，n=5）和谷氨酰胺灌胃组（G组，n=15）。其中谷氨酰胺灌胃组根据不同的灌胃量［1g/（kg·d）、3g/（kg·d）、5g/（kg·d）］分为3个亚组G1组（n=5）、G3组（n=5）、G5组（n=5）。NC组正常饮食，饮水。S组和G组仅正常饮水。G组给予不同剂量谷氨酰胺水溶液灌胃，1次/d，0.5ml/次，共3次。NC组和S组给予生理盐水灌胃0.5ml/d。72h后脱颈法处死小鼠，取小肠组织。HE染色观察小肠绒毛发育；TUNEL法检测细胞凋亡；实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测小肠组织MFG-E8mRNA及MFG-E8蛋白表达。结果 饥饿72h后小肠绒毛呈现萎缩状态，绒毛高度、隐窝深度及绒毛面积均明显降低；黏膜上皮细胞凋亡增加；MFG-E8在基因水平和蛋白水平表达均增加。谷氨酰胺灌胃后小肠绒毛萎缩状态改善，黏膜上皮细胞凋亡减少，MFG-E8mRNA和蛋白均较单纯饥饿组降低，且mRNA降低与谷氨酰胺灌胃量呈剂量依赖。结论 MFG-E8可作为饥饿后反映小肠代偿功能的标志，MFG-E8升高可能是小肠饥饿损伤后的一种自我保护性反应。

谷氨酰胺 饥饿 小肠绒毛发育 凋亡 乳脂肪球上皮生长因子E8

临床上食管狭窄、肠瘘或上消化道根治性手术等术后的患者不能进食、不宜进食或不能经消化道直接进食，将导致肠黏膜的废用状态，出现肠黏膜饥饿。MFG-E8在维持肠道稳态中发挥重要作用。一方面可促进凋亡细胞的清除［1，2］，另一方面也可以促进肠上皮细胞的再生与修复［3］。本文分析小鼠在饥饿状态及谷氨酰胺灌胃后小肠的病理改变和MFG-E8的表达变化，探讨MFG-E8在小肠黏膜饥饿损伤中的作用。

1　材料与方法

1.1主要试剂 L-谷氨酰胺（北京普博欣生物科技有限责任公司）；MFG-E8多克隆抗体（美国R&D公司）；辣根过氧化物酶标记的猴抗山羊IgG（美国Jackson公司）；actin抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（美国Jackson公司）；化学发光检测（ECL）试剂盒（美国Milipore公司）；细胞凋亡原位检测试剂盒，POD（德国罗氏公司）。

1.2动物模型制备与分组 雄性C57BL/6小鼠25只（上海交通大学医学院附属新华医院动物房代购），8～10周龄，体重（21±2）g。适应性喂养1周后随机分为对照组（NC组，n=5），饥饿组（S组，n=5），谷氨酰胺组（G组，n=15）。其中谷氨酰胺灌胃组根据不同的灌胃量［1g/（kg·d）、3g/（kg·d）、5g/（kg·d）］分为3个亚组G1组（n=5）、G3组（n=5）、G5组（n=5）。NC组给予正常饮食、饮水。S和G组仅正常饮水。G组分别予以不同剂量谷氨酰胺水溶液灌胃，0.5ml/次，共3次。NC组和S组给予生理盐水0.5ml/d灌胃。72h后脱颈法处死小鼠，取小肠组织，一部分多聚甲醛固定，其他标本置液氮中速冻后-80℃冻存备用。

1.3光镜测小肠绒毛发育 在距回盲部约1cm远处取约0.5cm长小肠组织，4%多聚甲醛固定24h，后梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片。HE染色切片后应用奥林巴斯（中国）有限公司Cell Sens显微图象软件测定小肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛面积，并观察小肠黏膜形态在发育中的变化。

1.4TUNEL法测凋亡 操作步骤按罗氏试剂盒说明书进行。取组织切片常规脱蜡水合，3%H2O2甲醇室温下封闭10min，3%BSA室温封闭20min，20μg/ml蛋白酶K作液，室温反应10min，滴加50μl TUNEL反应混合液（酶反应液与标记液的比例为1：9），湿盒中37℃避光反应1h。再滴加50μl POD转换液，湿盒中37℃避光湿润反应30min，DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。结果判断：胞核呈现棕黄色为阳性细胞。

1.5Real-Time PCR 总RNA提取采用TRIzol法，按照Invitrogen公司的TRIzol说明书提取细胞总RNA。提取后的总RNA 的浓度及纯度用ND-1000（美国NanoDrop Technologies公司）核酸蛋白定量仪测定。提取的RNA（2μg）采用Oligo（dT）引物（上海捷瑞生物工程有限公司）进行逆转录反应（反应体系：25μl）。Real-Time PCR反应采用TaKaRa公司的SYBR® Premix Ex taqTMReal-time PCR的操作步骤，在ABI Prism 7300荧光定量PCR仪上检测。反应体系20μl，扩增条件： 95℃预变性30s，40个循环（95℃5s，60℃31s）， 溶 解 曲 线（95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s）。目的基因及内参照引物序列如下：MFG-E8 forward：5'-CCTTCACCCTTTCCCTCAC-3'，reverse：5'-CACATACCCCAACTTCACTCTT-3'；β-actin：forward：5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3'，reverse：5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3'。

1.6MFG-E8蛋白含量测定 采用蛋白质免疫印迹法。用Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate蛋白定量，取蛋白样本100μg经质量分数为7.5%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，将蛋白电转移至用甲醇活化后的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%的脱脂牛奶室温封闭1h，用封闭液稀释MFG-E8多抗（0.1μg/ml）或actin（1：1000）抗体，4℃孵育过夜，含0.05%吐温（Tween）20的0.05mol/L Tris-NaCl溶液（TBST）洗脱3次，室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗溶液（1：2500）孵育2h，TBST洗脱3次，ECL显色。

1.7统计学方法 采用SPSS13.0软件。计量资料以（x±s）表示，行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般情况 NC组小鼠一般情况良好，S组小鼠体重下降明显，饥饿24h体重下降最快。饥饿24h后出现明显觅食行为，多动；48h毛色失去光泽，掉毛明显；72h活动明显减少，但无小鼠死亡。谷氨酰胺灌胃后体重下降较单纯饥饿组略减轻，其中3g/（kg·d）组改善最明显。

2.2光镜测小肠绒毛发育 对照组小肠黏膜形态未见异常，绒毛浓密，上皮细胞排列整齐（见图1a）。饥饿组黏膜层厚度变薄，绒毛数量减少、短粗，隐窝上皮细胞缺失，隐窝结构破坏，深度降低、呈萎缩样改变（见图1b）。谷氨酰胺灌胃后绒毛生长发育明显改善，绒毛高度、隐窝深度及绒毛面积均明显升高，尤其以灌胃3g/（kg·d）组绒毛发育为佳（见图1c、1d、1e）。S组小肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛面积均明显低于NC组；G3组小肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛面积均明显高于S组；G1和G5仅隐窝深度较S组明显升高（P＜0.01）见图2。

图1　光镜测小肠绒毛

2.3TUNEL法测凋亡 NC组可见一定程度凋亡，但不明显；S组较NC组凋亡明显增加，以绒毛顶端为甚，主要为绒毛上皮细胞。G组各亚组凋亡情况相较于S组均减少，G3组为甚，见图3。

图2　各组绒毛形态比较

图3　镜下凋亡情况

2.4real-time PCR S组 MFGE8mRNA表达高于NC组（P＜0.05）。G组MFG-E8mRNA水平较S组下降，且随着谷氨酰胺灌胃剂量的增加MFG-E8mRNA降低越明显，其中G3和G5组与S组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

2.5Western Blot 对照组、饥饿组和谷氨酰胺组小肠组织均有MFG-E8蛋白表达。S组MFG-E8表达高于NC组，G组表达减少。见图5。

图4　各组MFG-E8表达比较

图5　各组Western Blot检测MFG-E8比较

3　讨论

MFG-E8（又名乳凝集素，BA46等）是一种具有EGF1-EGF2-C1-C2样结构域的分泌型糖蛋白［4］。MFG-E8最初以乳汁脂肪球膜表面的镶嵌型外周蛋白的形式被发现，近来发现其在几乎所有组织器官中均有表达，尤其在脾脏和淋巴结表达较多，肠道的表达量相对较少［5］。2002年，MFG-E8促进凋亡细胞被吞噬细胞清除的功能被发现［6］，表明对其的认识到了一个新的台阶，后来一系列研究均证实其在凋亡细胞的清除过程中发挥重要作用。同时，研究发现MFG-E8在维持肠道稳态，促进肠黏膜的修复中发挥重要作用［5，7］，意味着其作为一种新型的潜在的肠道炎症的治疗措施进入人们的视野。Chogle等报道指出在DSS诱导的C57BL/6J小鼠结肠炎的急性期MFG-E8的表达升高，炎症恢复阶段MFG-E8表达下降，在恢复时期给予重组MFG-E8蛋白治疗后炎症减轻并且上皮修复加强［8］。

本资料显示小鼠饥饿72h后小肠黏膜萎缩，绒毛高度、隐窝深度及绒毛面积较对照组均有不同程度的下降，这与饥饿后肠道缺少刺激，黏膜细胞更新减少有关。作为血液循环和体内游离氨基酸池中含量最丰富的氨基酸，谷氨酰胺是小肠黏膜细胞的主要能源物质，也是所有快速增殖细胞特别是免疫细胞的能源物质［9］。在饥饿、创伤、感染等病理状态下，补充外源性谷氨酰胺能够促进肠黏膜的生长，防止肠黏膜萎缩，维持肠黏膜的完整性［10，11］。本资料显示谷氨酰胺灌胃后肠黏膜的萎缩状态得以一定程度改善，小肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛面积较单纯饥饿组均增加。饥饿后黏膜萎缩的同时，作者还发现小肠上皮细胞凋亡的增加。谷氨酰胺灌胃后上皮细胞凋亡的改善进一步验证谷氨酰胺在肠黏膜应激状态下可发挥积极作用。同时，作者发现饥饿72h后小鼠小肠MFG-E8蛋白和mRNA均升高，谷氨酰胺灌胃后下降。据此，推测饥饿72h后小肠MFG-E8表达的增高，可能是机体自身的一种代偿保护机制：一方面，MFG-E8可促进肠上皮细胞沿隐窝-绒毛轴迁移［3］，使上皮细胞更新率增加以维持黏膜的完整性和上皮的稳态。MFG-E8升高促进小肠黏膜上皮细胞的增生和迁移，修复饥饿后损伤的黏膜屏障，另一方面清除凋亡细胞，避免凋亡细胞累积后发生继发性坏死，损害机体。谷氨酰胺灌胃后一定程度上改善了小肠的应激状态，因此MFG-E8表达随之下降。

本实验首次揭示饥饿72h后小鼠小肠MFG-E8在基因及蛋白水平的表达均升高，谷氨酰胺灌胃后MFG-E8表达较饥饿组减少。提示MFG-E8可作为小肠饥饿性损伤后自身保护作用的一种代偿分子，为今后采取干预措施，防治长期禁食患者的肠道黏膜损伤提供新的思路。

1Aziz M， Jacob A， Matsuda A， et al. Review： milk fat globule-EGF factor 8 expression， function and plausible signal transduction in resolving inflammation. Apoptosis， 2011， 16（11）： 1077～1086.

2Fricker M， Neher J J， Zhao J W， et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. The Journal of Neuroscience， 2012， 32（8）： 2657～2666.

3Bu HF， Zuo XL，Wang X，et al.Milk fat globule-EGF factor 8/ lactadherin plays a crucial role in maintenance and repair of murine intestinal epithelium. J Clin Invest，2007，117（12）：3673～3683.

4Shi J， Gilbert G E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood， 2003，101（7）： 2628～2636.

5Aziz MM， Ishihara S， Mishima Y，et al.MFG-E8 Attenuates Intestinal Inflammation in Murine Experimental Colitis by Modulating Osteopontin-Dependentvβ3 Integrin Signaling.J Immunol，2009，182（11）： 7222～7232.

6Hanayama R， Tanaka M， Miwa K， et al.Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.Nature，2002，417（6885）：182～187.

7Wu R， Dong W， Wang Z， et al. Enhancing apoptotic cell clearance mitigates bacterial translocation and promotes tissue repair after gut ischemia-reperfusion injury. Int J Mol Med. 2012，Sep，30（3）：593～598.

8Chogle A， Bu HF， Wang X， et al. Milk Fat Globule-EGF Factor 8 Is a Critical Protein for Healing of Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Molecular Medicine， 2011， 17（5～6）： 502.

9Reeds PJ， Burrin DG. The gut and amino acid homeostasis. Nutrition，2000，16：666～668.

10Neu J， DeMarco V， Li N. Glutamine： clinical app lications and mechanisms of action. CurrOp in Clin NutrMetab Care， 2002， 5：69275.

11Reeds PJ， Burrin DG. Glutamine and the bowel. J nutr， 2001， 131（9 Suppl）：2505s～2508s.

ObjectiveTo observe the effect of glutamine on intestinal milk fat globule-EGF factor 8 expression on thehungry mice. Methods Twenty-fi ve C57BL/6 male mice were randomly divided into fi ve groups： normal control group （NC，n=5），starvation group （S，n=5）and glutamine group（G，n=15）. G group received Glu 1.0 or 3.0 or 5.0 g/kg by gastric feeding once a day from the day of starvation and named G1 or G3 or G5 group respectively. NC group ate food and drank water freely.S and G group drank water only and were of no food supply.The mice were sacrifi ced in 72 hours after starvation.The intestine specimens were sampled for histological examination by HE staining and cell apoptosis detection by TUNEL assay.The expression of MFG-E8mRNA and protein was measured by Real-Time PCR and Western Blot. Results Starvation resulted in damage to the intestinal mucosa. Villus heights，crypt depths and villus areas were signifi cantly reduced and the intestine epithelial apoptosis was increased.The expression of MFG-E8 protein and mRNA were increased.Glutamine ameliorated villous atrophy and epithelial apoptosis.At the same time，glutamine decreased the MFG-E8 expression compared to S group. ConclusionAs a kind of protective protein which is closely related to intestinal mucosa damage repair，mice intestinal MFG-E8 protein and mRNA expressions increase after starvation and decrease after Glutamine gastric feeding.This suggests MFG-E8 may be a type of protective response to intestinal damages.

Glutamine Starvation Intestinal villus development Apoptosis MFG-E8

200092上海交通大学医学院附属新华医院（张利娟朱莎莎 杜隽铭）201203上海人类基因组研究中心（王颖 夏立亮 吴标）