敌百虫对蚯蚓体内几种解毒酶活性的影响

李 冰 ，白桂芬，谢 艳

（内蒙古赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰024000）

蚯蚓是土壤生态系统的一个组成部分，在食物链中是土壤生物与陆地生物之间传递的桥梁[1].由于蚯蚓具有独特的生物学作用，已被用于监测和指示土壤污染、评价外源污染物对土壤生态环境安全性的影响等方面[2].敌百虫是内蒙古赤峰市区蔬菜大棚经常使用的广谱有机磷杀虫剂.目前敌百虫作用于哺乳动物、鱼类和昆虫等动物的研究较多[3-8]，也有关于重金属对蚯蚓影响的研究[2]，但敌百虫对蚯蚓体内解毒酶活性影响的报道尚未发现.

自然界中的各种生物为避免受到内源性或外源性化学物质刺激，在进化过程中形成了一系列的代谢解毒酶系统[9].谷胱甘肽转移酶（GSTs）是其中最重要的酶系之一，它可清除生物体内的脂类过氧化物，催化谷胱甘肽（GSH）与亲电性中间代谢物结合，使之成为水溶性化合物排出体外，起到解毒作用，在植物、无脊椎动物和脊椎动物对重金属、杀虫剂以及除草剂等异源物质的解毒代谢中具有重要作用.在以蚯蚓作为指示动物的毒理学研究中，GSTs活性的诱导作用也常被作为指示重金属和杀虫剂污染的潜在分子标志物[10].乙酰胆碱酯酶（AChE）在蚯蚓的神经传递过程中起着重要作用，此酶主要用于评价有机磷农药和氨基甲酸酯类农药对蚯蚓的毒性情况.它广泛存在于动物组织中，能够特异性催化乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸，维持神经系统的正常生理功能[11].有机磷农药能够作用于神经突触中的AChE，导致神经传导功能的紊乱[12].羧酸酯酶（CarE）是昆虫体内重要的解毒酶系[13]，也是蚯蚓体内重要的解毒酶之一.

本实验采用滤纸接触法，研究敌百虫对蚯蚓的生态毒理效应以及敌百虫对蚯蚓体内的GSTs、AChE和CarE活性的影响.这一研究旨在明确敌百虫对土壤生物的毒性效应，为敌百虫对环境生物的影响做出早期预警，也为合理判定敌百虫对相关动物的毒害程度积累基础资料.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

供试动物：采集赤峰市区蔬菜大棚中质量为300～500 mg、大小一致、环带明显的健康成蚓.

供试敌百虫：南通江山农药化工股份有限公司生产，生产许可证号为XK13-200-00095，农药登记号为PD84108-5，产品标准号为GB334-2001.本研究采用质量分数为90%的敌百虫原药.

1.1.2 主要仪器与试剂

HC-2518小型冷冻高速离心机，由科大创新股份有限公司中佳分公司生产；ModeL680酶标仪，由BIORAD公司生产；GSTs测定试剂盒（型号：CK-E11062H）、AChE测定试剂盒（型号：CK-E10986H）、羧酸酯酶测定试剂盒（型号：CK-E11517H），均由南京建成生物工程研究所提供；磷酸二氢钠，由沈阳市华东试剂厂生产.

1.1.3 污染物实验质量浓度的设计

参照文献[6]，设定敌百虫质量浓度分别为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 和 0.07 g/L.

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒理实验

急性毒理实验方法参照白桂芬等[6]所做的敌百虫单一急性毒性实验.敌百虫处理蚯蚓后，实验室内常温培育48h，观察记录蚯蚓的死亡情况.

1.2.2 酶源制备

参照陈东亚等[7]的方法，于相同质量浓度梯度的3个培养皿中随机取处理后的蚯蚓2条，用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸取体表多余的水分，称重.GSTs的提取中按质量体积比1∶9加入0.1 moL/L、pH值6.5的磷酸盐缓冲液（AChE的提取中加入1/15 moL/L、pH值8.0的磷酸盐缓冲液；CarE的提取中加入0.2 moL/L、pH值7.0的磷酸盐缓冲液），加入石英砂冰浴匀浆，于冷冻高速离心机中4℃、GSTs与CarE在4 000 r/min、AchE在6 500 r/min下离心15 min后，取上清液作酶源，在4℃下保存备用.

1.2.3 解毒酶标准曲线的绘制

根据3种解毒酶试剂盒的操作程序，以标准品的质量浓度为横坐标，以对应的OD值为纵坐标绘制解毒酶的标准曲线.根据标准曲线，经Excel软件处理后得到3种酶的线性回归方程，分别如下：

式中：y为测得的OD值；x为酶活性；R为相关系数.

根据线性回归方程可计算在不同敌百虫质量浓度下3种酶的酶活性.

1.2.4 酶活性的测定

参照试剂盒测试的要求进行操作.

1.3 数据处理

采用SPSS13.0和EXCEL分析软件对数据进行处理.

2 结果

2.1 敌百虫对蚯蚓的急性毒理

在染毒48h后，各质量浓度敌百虫处理下的蚯蚓中毒症状及其死亡率与白桂芬等[6]得到的结果基本一致.蚯蚓表现出中毒症状，如身体柔软，环节较松弛，体色变深，有明显渗血现象，并且有黄色液体渗出.部分体节肿大，生殖环糜烂.敌百虫各质量浓度污染暴露48h对蚯蚓均产生致死效应，且蚯蚓死亡率随着敌百虫质量浓度的增大而升高，在实验设定的最高质量浓度时，蚯蚓的死亡率达70%左右.

2.2 敌百虫对蚯蚓体内酶活性的影响

在毒理实验的基础上研究不同质量浓度敌百虫对蚯蚓体内解毒酶活性的影响，结果如表1所示.

表1 各质量浓度敌百虫作用下蚯蚓体内解毒酶的活性Tab.1 Activity of detoxifying enzyme in earthworm treated with different massconcentrations of trichlorphon

2.2.1 敌百虫对蚯蚓体内GSTs活性的影响

表1显示，经不同质量浓度的敌百虫染毒处理48h后，同对照组相比，蚯蚓体内的GSTs活性均显著增加，处于激活状态.敌百虫质量浓度为0.06 g/L时，蚯蚓体内的GSTs活性达到最大，与对照组相比提高了79.5%.在敌百虫质量浓度小于0.06 g/L时，随着敌百虫质量浓度的增加，蚯蚓GSTs的活性总体上呈增加趋势；敌百虫质量浓度超过0.06 g/L时，蚯蚓GST的活性又急剧下降.

2.2.2 敌百虫对蚯蚓体内AChE活性的影响

不同质量浓度的敌百虫对蚯蚓体内AChE活性的影响程度不同.由表1可见，敌百虫质量浓度较低时，能够激发蚯蚓体内AChE的合成能力，加快合成速度，使AChE含量上升[9].敌百虫质量浓度达到0.04 g/L时，蚯蚓体内的AChE活性达到最大值.此后，随着敌百虫质量浓度的进一步升高至0.05 g/L，AChE活性下降，但仍高于对照组.敌百虫质量浓度继续升高至0.06 g/L后，蚯蚓体内的AChE活性低于对照组，即AChE的合成处于抑制状态.

2.2.3 敌百虫对蚯蚓体内Car E活性的影响

不同质量浓度的敌百虫作用于蚯蚓后，总体上处理组CarE活性高于对照组，即呈现促进作用.由表1可见，敌百虫质量浓度为0.04 g/L时，CarE活性达到最大；当敌百虫质量浓度小于0.04 g/L时，CarE活性随敌百虫质量浓度的增加呈上升趋势，说明敌百虫在低质量浓度范围内对CarE活性的促进作用随着质量浓度的增加不断加强；当敌百虫质量浓度大于0.04 g/L时，CarE活性呈下降趋势，即敌百虫在高质量浓度范围内随着质量浓度的增加对CarE活性的促进作用减弱.总之，敌百虫对蚯蚓体内的CarE有诱导作用，且低质量浓度的诱导作用强于高质量浓度.

3 讨论与结论

本研究采用不同质量浓度的敌百虫作用于蚯蚓，发现在研究的敌百虫质量浓度范围内，蚯蚓有中毒症状及死亡现象，且死亡率与敌百虫质量浓度呈正比关系.测定蚯蚓在染毒48h后体内解毒酶的活性，结果发现：蚯蚓体内GSTs、AChE和CarE 3种解毒酶的活性均是先随着敌百虫质量浓度的升高而增加，这可能是机体对敌百虫农药的适应性反应，解毒酶活性的提高有助于减少异源物质对机体的损伤，该结果与吴咚咚等[11]的发现相似.在一定质量浓度下解毒酶活性达到峰值后，随着敌百虫质量浓度的进一步提高，解毒酶活性下降，甚至低于对照组.3种解毒酶均是在敌百虫质量浓度为0.04 g/L活性很大，即该质量浓度下蚯蚓体内的解毒酶活性被充分激发，参与蚯蚓对有机磷类药剂的代谢作用.当敌百虫施用量超过蚯蚓机体承受范围时，解毒酶的活性急剧下降，蚯蚓所受毒害作用不可修复.

本研究为探讨蚯蚓抗药性机制，建立抗性生化检测提供理论依据，也为合理使用农药减少其不良负作用积累基础资料.

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