碱解法测定中华鳖肝脏RNA-DNA含量比值方法的改进

冀芳烁，杨振才

（河北师范大学生命科学学院，石家庄050024）

中华鳖是古老的次生水生爬行动物，隶属于龟鳖目（Testudinata）鳖科（Trionychidae），在动物界占有独特的地位.中华鳖是营养丰富的水生动物，在其养殖和资源管理的研究中，生长情况是最重要的研究指标之一.水生动物的生长速度多采用测定一段时间内动物体重的变化来获得，对于野生动物而言获得其生长速度困难，且无法反映动物的瞬时生长状况.近年来，许多学者开始探寻能够反映动物瞬时生长状况的指标.RNA-DNA含量比值（CRNA/CDNA）可以用来指示动物的生长速度、营养状态、健康状态以及生长潜能[1-4].RNA-DNA含量比值较传统营养生长指标能更加灵敏、快速地反映出动物体生长发育和营养状态的变化，能够对几小时或几天内的环境变化做出反应，而传统生长指标是较长时间内动物生长状况的平均值[5-7]，会掩盖瞬时的生长变化.

RNA-DNA含量比值作为瞬时生长指标的应用是基于如下假设：细胞中总RNA表达量会随着蛋白合成需求的增加以及动物体的生长而相应增加[1]，而每个细胞内DNA的含量是相对恒定的.因此RNA-DNA含量比值可以反映细胞积累合成蛋白的能力，被认为是能够反映生长的可靠指标[2-5].

碱解法测定动物组织内RNA-DNA含量比值的原理是RNA能够被碱解为酸溶性核苷酸，而DNA不会被分解.利用碱液和不同浓度的高氯酸使同一组织内的RNA和DNA分别沉淀分离，再通过紫外分光光度法测定其含量[8].

本实验整合了Buckley[9]和Robbins[10]发表的碱解法操作流程，以此作为基础，结合其他已发表的使用碱解法测定RNA-DNA含量比值的研究，比较操作细节中的差异，优化离心速率、37℃碱解水浴时间和碱解量.本研究旨在规范碱解法测定中华鳖肝脏组织RNA-DNA含量比值的操作流程，提升测量的稳定性和准确性，为今后相关实验提供方法上的参考.

1 材料和方法

1.1 匀浆液的制备

匀浆器中加入1 mL匀浆介质，冰上预冷.取同一中华鳖肝脏组织100 mg，冰上充分研磨3～5 min至无组织块存在.研磨后将匀浆液吸出，分装入2 mL离心管中，每管0.7 mL.同时还需要做2个空白对照，即在离心管内加入0.7 mL匀浆介质.

1.2 碱解法基本操作流程

加入0.35 mL浓度0.6 mol/L的PCA，冰浴15 min，4℃下相对离心力为10 000×g（N（r/min）=[G/（1.12×离心10 min.弃上清，沉淀加入1 mL浓度为0.2 mol/L的 PCA，4℃下 10 000×g离心 10 min.弃上清，沉淀加入0.7 mL浓度为0.3 mol/L的KOH，37℃水浴2h.之后冰浴10 min，加入0.35 mL浓度为1.5 mol/L的PCA，冰浴 10 min，4℃下 10 000×g离心 10 min.吸取上清液，260 nm处测定RNA的吸光度值.沉淀中加入1 mL浓度为 0.2 mol/L的 PCA，4℃下10 000×g离心10 min.弃去上清液，沉淀中加入1.1 mL浓度为0.6 mol/L的PCA.85℃水浴15 min，之后冰浴15 min.4℃下10 000×g离心10 min.吸取上清液，260 nm处测定DNA的吸光度.

1.3 实验设计

除处理因素差异外，其余操作均按1.1和1.2所描述的流程进行.

1.3.1 匀浆介质的比较

选取2种匀浆介质作为处理因素.Ⅰ号匀浆介质：浓度为0.05 mol/L的Tris-HCl+浓度为0.050 mol/L的EDTA.（pH 7.4）；Ⅱ号匀浆介质：浓度为0.05 mol/L的 Tris-HCl+浓度为 0.005 mol/L 的 EDTA（pH 7.4）.每个处理做3个重复.

1.3.2 离心速率的比较

选取4种离心速率作为处理因素，分别为3 000×g，6 000×g，10 000×g，12 000×g.每个处理做 2个重复.

1.3.3 碱解水浴时间的比较

选取2种37℃碱解水浴时间作为处理因素，分别为水浴1h和水浴2h.每个处理做3个重复.

1.3.4 碱解量的比较

选取2种碱解量作为处理因素，处理Ⅰ为0.56 mL浓度为0.3 mol/L的KOH碱解，之后用0.25 mL浓度为1.5 mol/L的PCA酸化沉淀DNA；处理Ⅱ为0.7 mL浓度为0.3 mol/L的KOH碱解，之后用0.35 mL浓度为1.5 mol/L的PCA酸化沉淀DNA.每个处理做3个重复.

1.4 核酸含量及RNA和DNA含量比值的计算

CRNA=A260nm（RNA）/0.03，CDNA=A260nm（DNA）/0.03式中：CRNA为RNA含量，CDNA为DNA含量，单位均为μg/mL；A260nm是指在260 nm处测得的吸光度值.计算核酸含量时核苷酸的消光系数为0.03[11].

1.5 数据分析

所有分析均使用统计软件STATISTICA（version6.0）进行.使用成组数据t检验分析比较匀浆介质、37℃碱解水浴时间和碱解量3个实验得到的CRNA、CDNA、RNADNA含量比值.使用单因素方差分析比较4种离心速度间的差异，p＜0.05时差异具有统计学意义.计算各种差异处理的变异系数CV（CV=标准差/平均数×100%）.

2 结果与讨论

2.1 匀浆介质对RNA-DNA含量比值测定的影响

分别采用2种匀浆介质处理中华鳖的肝脏组织，碱解分离后，RNA和DNA的含量以及比值情况如表1所示.

表1 不同匀浆介质处理下肝脏组织中RNA和DNA的分离结果（平均数±标准差）Tab.1 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different reagent for homogenizing

t检验结果显示，2种匀浆介质处理后所测得的CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值差异均没有统计学意义（p＞0.05），但是Ⅱ号匀浆介质的3个变异系数均小于Ⅰ号匀浆介质，即Ⅱ号匀浆可提高中华鳖肝脏组织RNA-DNA含量比值测定的稳定性.

2.2 离心速率对RNA-DNA含量比值测定的影响

在中华鳖肝脏组织的碱解过程中，不同离心速率对CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值的影响如表2所示.

表2 不同离心速率下肝脏组织中RNA和DNA的分离结果Tab.2 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different centrifuge speed

表2结果显示，4种离心速率所测得的CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值略有差异，但差异没有统计学意义（p＞0.05），12 000×g离心速率下 3个变异系数最小，即该离心速率能够提高中华鳖肝脏组织RNA-DNA含量比值测定的稳定性.

露斯塔野鲮（Labeo rohita）的肌肉组织和凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）的腹部肌肉组织RNA-DNA含量比值测定使用的离心速率是3 000×g[12-13]；欧洲大扇贝（Pecten maximus）的性腺RNA-DNA含量比值测定使用的离心速率是10 000×g[10]；大西洋鳕鱼（Gadus morhua）全鱼体RNA-DNA含量比值测定使用的离心速率是6 000×g[9].这些已有研究中使用不同的离心速率，可能是由于物种不同以及所取的组织不同，因此测定RNA-DNA含量比值的最佳离心速率不同.

2.3 碱解水浴时间对RNA-DNA含量比值测定的影响

考察中华鳖肝脏组织的碱解过程中，碱解水浴时间对CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值的影响，结果如表3所示.

表3 不同碱解水浴时间下肝脏组织中RNA和DNA的分离结果Tab.3 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different time of water bath at 37℃

t检验结果显示，碱解水浴时间2h的处理中，CRNA和RNA-DNA含量比值明显大于水浴时间1h的处理，差异具有高度统计学意义（p＜0.01）；水浴时间1h处理组的CDNA大于2h处理，差异具有统计学意义（p＜0.05）.变异系数方面，水浴2h处理组中，各项变异系数均较小.

露斯塔野鲮（Labeo rohita）的肌肉组织和凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）的腹部肌肉组织RNA-DNA含量比值测定研究中，分离RNA的碱解水浴时间是2h[12-14]；欧洲大扇贝（Pecten maximus）性腺和大西洋鳕鱼（Gadusmorhua）全鱼体RNA-DNA含量比值测定研究中，分离RNA的碱解水浴时间是1h[9-10].本实验比较2种常用的碱解水浴时间，结果表明37℃碱解水浴2h能够使中华鳖肝脏组织的RNA碱解更充分，同时能够提高测定的稳定性和准确性.

2.4 碱解量对RNA-DNA含量比值测定的影响

不同碱解量下中华鳖肝脏组织中RNA和DNA的分离情况如表4所示.

表4 不同碱解量下肝脏组织中RNA和DNA的分离结果Tab.4 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different quantity of alkaline

t检验结果显示，处理Ⅰ中 CRNA、CDNA、RNA-DNA含量比值均高于处理Ⅱ，2个处理组间CRNA和RNADNA含量比值的差异具有统计学意义（p＜0.05）.由此可见，处理2加大碱解量和酸化沉淀的PCA量会降低肝脏组织CRNA以及RNA-DNA含量比值，同时各项变异系数变大.

已发表研究中[9-13，15]由于物种不同以及所取组织不同，测定RNA-DNA含量比值的最佳分离RNA沉淀DNA的碱解量和酸化的PCA量也不相同.本实验比较2种常用的碱解量，结果表明0.56 mL浓度为0.3 mol/L的KOH+0.25 mL浓度为1.5 mol/L的PCA的碱解酸化组合能够提高中华鳖肝脏组织RNA-DNA含量比值测定的稳定性.

3 结论

本实验在测定中华鳖肝脏组织RNA-DNA含量过程中，对匀浆介质的组成成分、离心速率、37℃碱解水浴时间和碱解量这4项操作细节进行了优化.最终认为在碱解法基本操作流程的基础上，使用以0.05 mol/L的Tris-HCl+浓度为 0.005 mol/L 的 EDTA（pH 7.4）作为主要成分的匀浆介质，使用12 000×g离心速率，37℃碱解水浴2h，0.56 mL浓度为0.3 mol/L的KOH+0.25 mL浓度为1.5 mol/L的PCA的碱解酸化组合，能够提升测定中华鳖肝脏组织RNA-DNA含量比值的稳定性和准确性.

[1]BUCKLEY L，CALDARONE E，ONG T L.RNA-DNA ratio and other nucleic acid-based indicators for growth and condition of marine fishes[J].Hydrobiologia，1999，401：265-277.

[2]ROOKER JR，HOLTG J，HOLTSA.Condition of larval and juvenile red drum（Sciaenops ocellatus）from estuarine nursery habitats[J].Mar Biol，1997，127（3）：387-394.

[3]OKUMURAT，NAGASAWAT，HAYASHII，etal.Effectsof starvation on RNA ∶DNA ratio，glycogen content，and C ∶N ratio in columellar muscle of the Japanese turban shell Turbo （Batillus） cornutus（Gastropoda）[J].Fish Sci，2002，68（2）：306-312.

[4]ISLAM MS，TANAKA M.Nutritional condition，starvation status and growth of early juvenile Japanese sea bass（Lateolabrax japonicus）related to prey distribution and feeding in the nursery ground[J].JExp Mar Biol Ecol，2005，323（2）：172-183.

[5]VIDALEA G，DIMARCOP，LEEP.Effectsof starvation and recovery on the survival，growth and RNA/DNA ratio in loliginid squid paralarvae[J].Aquaculture，2006，260（1/2/3/4）：94-105.

[6]AKHTARM S，PAL A K，SAHUN P，et al.Physiological responsesof dietary tryptophan fed Labeo rohita to temperatureand salinity stress[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2013，97（6）：1075-1083.

[7]CHEUNG CH Y，CHAILLE PM，RANDALL D J，et al.The use of scale increment as a means of indicating fish growth and growth impairment[J].Aquaculture，2007，266（1/2/3/4）：102-111.

[8]王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学[M].3版.北京：高等教育出版社，2002.

[9]BUCKLEY L J.Relationships between RNA-DNA ratio，prey density，and growth rate in Atlantic Cod（Gadus morhua）larvae[J].JFish Res Board Can，1979，36：1497-1502.

[10]ROBBINS I，LUBET P，BESNARD J Y.Seasonal variations in the nucleic acid content and RNA∶DNA ratio of the gonad of the scallop Pecten maximus[J].Marine Biology，1990，105（2）：191-195.

[11]KUROPAT C，ALLEN R M，CALDARONE E，et al.Evaluation of RNA concentration as an indicator of growth in young-of-the-year winter flounder Pseudopleuronectes americanus and tautog Tautoga onitis[J].Marine Ecology Progress Series，2002，230：26-274.

[12]ABIDI S F，KHAN MA.Dietary arginine requirement of fingerling Indian major carp，Labeo rohita（Hamilton）based on growth，nutrient retention efficiencies，RNA/DNA ratio and body composition[J].JAppl Ichthyol，2009，25（6）：707-714.

[13]MOSS S M.Use of nucleic acids as indicators of growth in juvenile white shrimp，Penaeus vannamei[J].Marine Biology，1994，120（3）：359-367.

[14]梁萌青，王士稳，王家林，等.海水养殖与低盐养殖凡纳滨对虾生长性能，酶活及 R/D 比值的差异[J].海洋水产研究，2008，29（4）：69-73.

[15]ALLEN R M，KUROPAT C，CALDARONE E.A model to estimate growth in young-of-the-year tautog，Tautoga onitis，based on RNA/DNA ratioand seawater temperature[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2006，329（2）：187-195.