双氧水对聚苹果酸脱色效果探究

孟迪，乔长晟，2，*，宋玉民，范栩嘉，徐硕涵

（1.天津科技大学工业微生物教育部重点实验室，天津300457；2.天津北洋百川生物技术有限公司，天津300457）

双氧水对聚苹果酸脱色效果探究

孟迪1，乔长晟1，2，*，宋玉民1，范栩嘉1，徐硕涵1

（1.天津科技大学工业微生物教育部重点实验室，天津300457；2.天津北洋百川生物技术有限公司，天津300457）

研究了双氧水对聚苹果酸脱色及其对聚苹果酸的影响，确定最佳脱色工艺。结果以脱色效果、聚苹果酸损失率和分子量为指标，在单因素筛选的基础上，采用正交试验法对脱色工艺进行优选，并对聚苹果酸进行结构表征。最终确定脱色最佳工艺为：双氧水添加量15%（体积比）、温度60℃、时间4 h、pH 10；红外光谱和核磁共振结果显示双氧水处理后部分聚苹果酸氧化。且纯度比未用双氧水处理时要高，可以选用此种方法进行快速有效的脱色。

过氧化氢；聚苹果酸；红外光谱分析；核磁共振

聚苹果酸（Poly malic-acid，简称PMLA）是以苹果酸为唯一单体的均聚高分子聚合物。由于苹果酸含有两个羧基和一个羟基，其相互酯化的产物主要有3种，即α型、β型、γ型，生物体内存在的只有β型。聚苹果酸具有优良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性，它可在水溶液中自发或酶促降解生成小分子L-苹果酸，该单体通过三羧酸循环［1］很容易地从人体内代谢出来并无任何毒副作用。聚苹果酸分解或燃烧后，最终产物是二氧化碳和水，可被植物吸收，对环境无毒无害［2］。聚苹果酸的这些特有的性质使其在医药、化妆品、环境治理以及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。目前聚苹果酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法［3］，化学合成法工艺复杂、有机溶剂残留难以去除；而发酵法生产聚苹果酸成为国内近年来研究比较热的课题。发酵液是一种非常复杂的多元混合体系，色素是其中的一类。发酵液中的色素来源主要有3种：一是原料本身带有的；二是来自于发酵过程中的菌体代谢；三是产生于发酵液某些成分的相互反应，例如残糖与溶液中的含氮物质在高温下反应产生有色物质［4-6］。色素的存在不仅影响产品的外观，而且涉及产品是否符合标准，所以，脱色是提取发酵液中聚苹果酸的必要步骤。因此，从发酵液中提取色素较少的聚苹果酸是一个重要的课题。本文对双氧水的脱色条件做了系统研究，并进一步探究使用双氧水脱色对聚苹果酸的影响，得到了双氧水在聚苹果酸提取脱色中的优化条件及其对聚苹果酸分子量和结构的影响。

1材料与方法

1.1材料

聚苹果酸发酵液：本研究室经5L发酵罐发酵提供，pH6.5～7.0，聚苹果酸在发酵液中以钙盐形式存在，含量40 g/L左右。

30%双氧水（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；葡聚糖（分析纯）：北京奥博星生物技术有限公司；L-苹果酸（分析纯）：百灵威科技有限公司；无水甲醇（分析纯）：天津市康科德科技有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：天津市化学试剂一厂；乙腈（色谱纯）：天津市索祥化学品有限公司；硫酸钠（分析纯）：维科特（天津）化工产品贸易有限公司。

1.2主要仪器设备

UV-1800PC紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；SC6010电子天平、FE20pH计：梅特勒-托利多常州衡器有限公司；Agilent 1200高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机：河南兄弟仪器设备有限公司；VECTOR22型傅里叶变换红外光谱：布鲁克仪器公司；AVANCE型核磁共振谱仪：布鲁克拜厄斯宾有限公司。

1.3试验方法

1.3.1聚苹果酸的提取与精制

将发酵液4 200 r/min离心30 min，去菌体，向上清中按体积比添加甲醇，添加量为20%（体积比）将沉淀出的部分多糖去除后再继续添加甲醇使其添加量达到60%（体积比）此时得到的沉淀即为聚苹果酸量较高的聚苹果酸粗品，其纯度可以达到67.3%。取聚苹果酸粗品溶解100 mL水中加普鲁兰多糖酶水解普鲁兰多糖，水解条件是水解时间为60 min、添加量为2.5%（体积比）、水解温度为55℃。继而超滤去除离子和小分子多糖［7］，此时纯度达到86.5%。称取上述聚苹果酸样品20 g，加1 000 mL蒸馏水，搅拌使充分溶解，考虑双氧水有较强的氧化性而破坏聚苹果酸样品，故实验以脱色效果、聚苹果酸损失率和聚苹果酸分子量为测定指标。

1.3.2脱色率的计算

对聚苹果酸发酵液进行了可见-紫外光谱700 nm～200 nm的扫描，结果表明溶液无最大吸收波长，根据聚苹果酸溶液脱色前后均为橙黄色，故从溶液的互补色考虑选择450 nm为检测波长测定其吸收度。并按下式计算脱色率：

式中：A为脱色前吸光度；A0为脱色后吸光度。

1.3.3聚苹果酸含量的检测

采用水解的方法将聚苹果酸水解成苹果酸单体，再采用反向高效液相色谱的方法测定水解液中苹果酸的含量，并折算成聚苹果酸的含量，进而计算聚苹果酸的损失率。

1.3.3.1液相流动相的配制

准确秤取磷酸二氢钾3.402 5 g，溶于娃哈哈纯净水中，定容1 000 mL，配成0.025 mol/L的磷酸二氢钾溶液。将该溶液与乙腈以95∶5（体积比）的比例混合均匀后，将该混合溶液的pH调至2.0。

1.3.3.2聚苹果酸的预处理

将聚苹果酸样品配成适当的浓度，将该溶液与1 mol/L的硫酸以1∶1（体积比）的比例混合均匀置于90℃烘箱内水解9 h。将得到的水解液进行粗过滤后，再用0.22 μm的滤膜过滤。

1.3.3.3标准曲线的制作

用流动相分别精确配置1、2、4、6、8、10 g/L等不同浓度的标准L-苹果酸溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，利用液相色谱检测，检测条件为：进样5 μL，流速1 mL/min，柱温25℃，检测波长210 nm，得出色谱图，得出峰面积，以质量浓度（y）对样品峰面积（X）进行线性回归，得回归方程：y=214.2X+6.758，相关系数r=0.999 1。

1.3.3.4聚苹果酸样品的测定

将水解后并过膜的水解液用液相色谱检测，检测条件同上，记录峰面积，将得到的峰面积与标准曲线进行对比得出水解液中苹果酸的浓度，将此苹果酸的浓度经过折算得到样品中聚苹果酸的百分含量。并按下式计算损失率：

式中：C0为发酵液中聚苹果酸百分含量；C为双氧水脱色后发酵液中聚苹果酸百分含量。

1.3.4聚苹果酸分子量的测定

1.3.4.1流动相配制

0.05mol/L硫酸钠：精确称取7.102 5 g硫酸钠于烧杯中用娃哈哈水溶解并定容至1 L。

1.3.4.2聚苹果酸的处理

将聚苹果酸样品用流动相稀释到适当的浓度，用0.45 μm的水膜过滤后，置于进样瓶中备用。

1.3.4.3标准曲线的制作

用流动相分别精确配置2 g/L等不同分子量的标准葡聚糖溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，利用液相色谱检测，检测条件为：进样20 μL，流速0.5 mL/min，柱温25℃，检测器温度30℃，得出色谱图，绘制标准曲线。

1.3.4.4聚苹果酸样品的测定

将上述处理过的聚苹果酸样品用液相色谱检测，检测条件同上，根据出峰时间及标准曲线进行积分得到Mw。

1.3.5聚苹果酸核磁共振扫描

1H NMR频率400.13 MHz，90℃脉冲25 μs，脉冲延迟时间3.6 s，累加100次，溶剂D2O，样品称取50 mg溶至500 μL重水中，控温误差±0.1℃。

13C NMR频率100.62 MHz，90℃脉冲14 μs，脉冲间隔1.5 μs，宽带噪音去偶，累加65 000次，溶剂D2O，样品称取80 mg溶至500 μL重水中，控温误差±0.1℃［8］。

1.3.6红外光谱扫描［9］

1.3.6.1样品的制备

将光谱级KBr磨细干燥，置于干燥器中备用，取1 mg～2 mg干燥样品，并以1：（100-200）（g/g）比例的干燥KBr粉末，一起在玛瑙研钵中于紫外灯下研磨，直到完全研磨混匀（粉末粒径2 μm左右）。将研好的粉末均匀放入压膜器内，抽真空后，加压至50 MPa～100 MPa，得到透明或半透明的薄片。

1.3.6.2检测

将制备好的样品薄片置于样品架上，即可进行红外光谱测试，扫描范围为4 000 cm-1～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为16。由于KBr吸湿性强，不可避免会有游离水的吸收峰出现，为了扣除KBr的吸收，在同样条件下制备同样厚度的KBr薄片作参比。

2结果与分析

2.1时间对脱色效果的影响

取10 mL聚苹果酸溶液置于25 mL三角瓶中，加入3%的30%过氧化氢，50℃，不同反应时间，冷却，分别测在450 nm处的吸光值以计算其脱色率并液相检测聚苹果酸含量、分子量。结果见表1。

由表1可以看出，随着时间的增加，脱色效果增大明显，但在8 h后变化不大，而PMLA损失率逐渐增大，分子量逐渐降低，在8 h后损失率和分子量变化幅度很大，所以脱色时间应不超过8 h。

2.2pH对脱色效果的影响

取10 mL聚苹果酸溶液置于25 mL三角瓶中，加入3%的30%过氧化氢，用盐酸调pH，50℃，在不同的pH条件下反应4 h，冷却，分别测在450 nm处的吸光值以计算其脱色率并液相检测聚苹果酸含量、分子量。结果见表2。

表1　脱色时间对双氧水脱色效果、PMLA损失率和分子量的影响Table 1Influence of time on decoloration，loss ratio and molecular weight of PMLA

表2　pH对双氧水脱色效果、PMLA损失率和分子量的影响Table 2Influence of pH on decoloration，loss ratio and molecular weight of PMLA

由表2可以看出，脱色率随pH的升高而增加，在酸性和强碱性条件下PMLA损失很大，且分子量降低明显，因为聚苹果酸在酸性条件下容易水解，所以分子量有所降低，而双氧水在水溶液中电离出过氧氢根离子攻击色素和聚苹果酸，在碱性条件下，其电离度增大，所以脱色作用增强的同时聚苹果酸的损失率增加、分子量降低。因此脱色pH应控制为9左右。

2.3温度对脱色的影响

取10 mL聚苹果酸溶液置于25 mL三角瓶中，加入3%的30%过氧化氢，不同温度条件下反应4 h，冷却，分别测在450 nm处的吸光值以计算其脱色率并液相检测聚苹果酸含量、分子量。结果见表3。

表3　温度对双氧水脱色效果、PMLA损失率和分子量的影响Table 3Influence of temperature on decoloration，loss ratio and molecular weight of PMLA

由表3可以看出，脱色率随着温度的升高而升高，在80℃后，变化不大，说明双氧水对聚苹果酸溶液中色素的吸附趋于平衡，而随温度升高聚苹果酸损失率升高、分子量降低。综合脱色率、聚苹果酸损失率和聚苹果酸分子量变化，应将脱色温度控制在60℃左右。

2.4双氧水用量对脱色的影响

取10 mL聚苹果酸溶液置于25 mL三角瓶中，调pH 9～10，50℃，加入不等量双氧水反应4 h，冷却，分别测在450 nm处的吸光值以计算其脱色率并液相检测聚苹果酸含量、分子量。结果见表4。

表4　双氧水用量对双氧水脱色效果、PMLA损失率和分子量的影响Table 4Influence of the amount of H2O2on decoloration，loss ratio and molecular weight of PMLA

由表4可以看出，脱色率随着双氧水用量的升高而升高，然而，随着双氧水用量的增高，聚苹果酸损失率增加、分子量降低，在用量为聚苹果酸溶液体积的30%后，光密度值变化不大，而在用量为30%以后，聚苹果酸损失率急剧增加、分子量降低幅度明显变大，说明双氧水用量不宜过大，用量应控制为30%以内。

2.5正交试验因素水平表的设计与试验

按单因素试验的结果，选择pH、温度、时间、双氧水用量按L18（37）安排正交试验。因素水平设计见表5。

表5　正交试验设计各因素及水平Table 5Levels of factors used in the orthogonal experimental design

称聚苹果酸粗品10 g，加500 mL水溶解，分别取10 mL聚苹果酸溶液置于25 mL三角瓶中，按正交试验方案进行脱色，冷却，定容，测定脱色率、聚苹果酸损失率和分子量，以三者作为衡量脱色效率的指标。试验结果及方差分析见表6～表8。

表6　正交试验表及结果Table 6Orthogonal analysis test

图1　不同处理方式下的PMLA的核磁共振C谱图Fig.113C-NMR spectrum of PMLA by different treatment methods

表7　脱色率方差分析表Table 7The anova table of decoloring rate

表8　聚苹果酸损失率方差分析表Table 8The anova table of loss ratio of PMLA

图2　不同处理方式下的PMLA的核磁共振H谱图Fig.21H-NMR spectrum of PMLA by different treatment methods

表9　聚苹果酸分子量方差分析表Table 9The anova table of molecular weight of PMLA

由表7～表9可看出，双氧水对脱色率、损失率和分子量的影响因素分别为A＞D＞B＞C、B＞D＞A＞C和A＞B＞C＞D，其中A因素各水平对脱色率和分子量均有显著差异，B因素各水平对损失率有显著差异，由于因素C和D没有显著性差异，考虑以脱色率为主，同时缩短时间，提高效率，故最佳脱色条件为的较优水平组合为A2B2C1D3。

2.6验证试验

取10 mL聚苹果酸溶液置于25 mL三角瓶中，按正交试验所得结果得出脱色的最佳条件进行，测得脱色率、聚苹果酸损失率和分子量分别为92.1%、10.8%和5 011。结果表明实验所确定的工艺为最佳工艺条件。其中，该条件下处理的聚苹果酸液相检测其纯度为90.1%，比未经双氧水处理的纯度略高。

2.7核磁共振扫描和红外光谱检测

在进行核磁检测时采用的D2O溶解聚苹果酸，所以会形成氢键产生一些杂峰影响结果，但图1（a）和图1（b）对比，发现PMLA经双氧水处理与不处理之后的C谱结果差异很小，说明经双氧水处理后的聚苹果酸基本结构未发生变化；图2（a）和图2（b）对比，发现经双氧水处理过的PMLA在2.0×10-6出现弱峰，其它均一致，其中1.5×10-6～2.5×10-6是羰基区域，可能是双氧水氧化聚苹果酸造成的；图3（a）和图3（b）的红外结果对比，发现双氧水处理后的聚苹果酸在2 339.06 cm-1处出现较弱的吸收峰，而频率范围在2 500 cm-1～2 000 cm-1区为三键或者累积双键区，可能是聚苹果酸发生部分氧化，此结果与核磁共振H谱结果一致。

图3　不同处理方式下的PMLA的红外光谱图Fig.3Infrared spectra of PMLA by different treatment methods

3讨论

聚苹果酸提取物的脱色方法有活性炭法、双氧水法和树脂脱色法。活性炭脱色产品颜色较重，且脱色后溶液中的活性炭残渣难于完全除去，但是，使用该方法进行脱色对提取物影响效果小，属于物理吸附；树脂脱色效果最好，脱色工艺简单，但树脂价格较高，一次性投资较大，且需再生使用，生产周期较长，适合少量样品的脱色，不适合工业化大生产；双氧水脱色操作简便，脱色效果较好，产品颜色较浅，但对聚苹果酸具有较强的氧化作用，因此在使用时一定要控制好条件。

［1］宋超，张立军，贾永光，等．植物的苹果酸代谢和转运［J］．植物生理学通讯，2009，45（5）:419-428

［2］刘建军，姜鲁燕，赵祥颖，等．L-苹果酸的应用及研究进展［J］．中国食品添加，2003，32（3）:53-56

［3］Lee B S，Vert M，Holler E．Biopolymer:Vol.3［M］.Weinheim:Wiley-VCH，2002:75-103

［4］楼良旺，高年发．丙酮酸发酵液脱色工艺的研究［J］．广州食品工业科技，2004，20（3）:12-14

［5］范峰辛，体明友．长链二元酸的提取工艺研究［J］．精细与专用化学品，2004，12（23）:25-27

［6］周卫斌，周样山．毕赤酵母发酵液的脱色和重组水蛭素的分离［J］．生物工程学报，2001，17（6）:683-686

［7］牛登飞．发酵液中普鲁兰多糖提取工艺条件的研究［D］．无锡:江南大学，2009:12-16

［8］王雪松．出芽短梗霉原生质体激光诱变及普鲁兰的纯化和表征［D］．吉林:吉林大学，2003:34-35

［9］朱淮武．有机分子结构波谱解析［M］．北京:化学工业出版社，2010: 29-31

Study of Decoloration Effect on Poly Malic Acid by H2O2

MENG Di1，QIAO Chang-sheng1，2，*，SONG Yu-min1，FAN Xu-jia1，XU Shuo-han1
（1.Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Beiyang Biotrans Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

The objective of this study was to discuss the decolorization effect on poly malic acid by H2O2and determine the optimal bleaching process.The decolorization effect，loss ratio and molecular weight of PMLA were used as indexes.Based on the single factor experiment，the orthogonal design was applied to select the optimal condition for the decolorization of PMLA.The apparent structure of PMLA was determined under this optimal condition.As a result，the optimal extraction conditions were as follows：the volume addition of H2O2was 15%，the temperature was 60℃，the bleaching time was 4 hours and the bleaching pH was 10.The result of FT-IR and HMR showed that the PMLA dealt with H2O2was partly oxidized.The purity of PMLA was higher than untreated with H2O2.This kind of method can be chosen for fast and efficient decolorization.

H2O2；poly malic acid；FT-IR；NMR

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.009

2014-09-01

孟迪（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：氨基酸与有机酸发酵。