乳源嗜冷菌产胞外耐热酶检测方法的对比分析

王伟军，李延华

（1.贝因美婴童食品股份有限公司，浙江杭州311106；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018）

乳源嗜冷菌产胞外耐热酶检测方法的对比分析

王伟军1，李延华2

（1.贝因美婴童食品股份有限公司，浙江杭州311106；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018）

乳及乳制品中污染的嗜冷菌可分泌耐热的胞外蛋白酶和脂肪酶，直接影响产品品质。介绍从乳体系中分离鉴定的嗜冷菌种类，指出荧光假单胞菌是产胞外蛋白酶和脂肪酶的主要嗜冷菌菌株；分别阐述乳中污染的嗜冷菌所分泌蛋白酶和脂肪酶的热稳定性，并比较乳体系中耐热酶的测定方法，期望为有效预测乳中嗜冷菌污染程度、在线检测和控制耐热酶活性、提升乳制品的质量提供理论参考。

乳；嗜冷菌；蛋白酶；脂肪酶；检测方法

乳品工业中嗜冷菌被定义为在7℃或者7℃以下能够繁殖的一类细菌，是一类能引起乳品腐败的微生物［1］。目前，嗜冷菌是乳与乳制品加工过程中最为关键的腐败菌。已有研究指出：并不是嗜冷菌本身导致原料乳、液态奶、乳粉等腐败变质，而是其分泌的胞外酶作用产生［2］。作为冷藏原料乳中生长的优势菌群，在原料乳贮存过程中可以产生耐热的脂肪酶和蛋白酶，这些酶类在巴氏杀菌或高温杀菌处理后仍会有残留，并在乳制品贮藏过程中继续分解其中的脂肪和蛋白质，导致产品的风味和质地产生变化。脂肪酶主要是分解脂肪产生酸败味及其它风味缺陷，蛋白酶主要是引起乳中蛋白质分解导致酪蛋白胶束不稳定和乳发生凝固现象［3］。因此，原料乳及乳制品的质量监测中检测热稳定性蛋白酶和脂肪酶比直接检测嗜冷菌更有现实意义。

1乳中污染的嗜冷菌的种属特性

原料乳中已经分离出很多菌属嗜冷菌，包括革兰氏阴性菌：假单胞菌、气单胞菌、灵杆菌、不动杆菌、产碱杆菌、无色杆菌、肠道细菌、不动杆菌和革兰氏阳性菌：芽胞杆菌、梭状芽胞杆菌、棒状杆菌、细球菌属、链锁状球菌、葡萄球菌、乳（酸）杆菌。其中假单胞菌属是文献中报道最多的一类菌［4］。Kumaresan.G提出假单胞菌属中荧光假单胞菌（Ps.fluorescens）、恶臭假单胞菌（Ps.putida）、莓实假单胞菌（Ps.fragi）、腐败假单胞菌（Ps.putrefaciens）和铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa）是缩短液态乳4℃贮藏货架期的主要微生物［5］。Martin分析从乳中分离的假单胞菌，指出假单胞菌属的五种基因型中，Ps．fluorescens，可能还有Ps.fragi能够稳定的产生脂肪酶、蛋白酶和软磷脂酶，而分离出来的22种假单胞菌中只有2株Ps.putida具有脂肪酶和蛋白酶活性［6］；Swart等报道从原料乳中分离的44株Ps.Putida中43株不具有脂肪和蛋白分解作用［7］。因此，Ps.fluorescens是最主要的分泌脂肪酶和蛋白酶的影响原料乳品质的假单胞菌株。

2乳中嗜冷菌产生的耐热蛋白酶

2.1嗜冷菌蛋白酶的耐热性

嗜冷菌通常在对数生长期后期及稳定期最大程度的产生蛋白酶。原料乳中嗜冷菌产生的蛋白酶有三种形式，即胞内蛋白酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶。目前研究集中于胞外蛋白酶，多数属于耐热性的碱性金属蛋白酶，Zn2+和Ca2+是酶活性中心。Fairbairn等指出假单胞菌主要产生一种类型以Zn2+为活性中心的胞外蛋白酶，分子量40 ku～50 ku，最适温度30℃～40℃，最适pH为6～8［8-9］。

嗜冷菌所分泌蛋白酶的耐热机理在于经过高温处理后，未被破坏的处于非折叠状态的蛋白酶分子（无活性）重新折叠成有活性的天然构象［2］。大多数嗜冷菌产生的胞外蛋白酶对热处理具有高度的稳定性。Griffiths等研究了13株假单胞菌蛋白酶的热稳定性，经77℃、17 s的加热处理可保留55%～65%的活性，140℃、5 s后仍能保留20%～40%的活性［10］。Adams发现10种不同的假单胞菌蛋白酶在pH7.5的缓冲液中经149℃、10 s热处理后仍具有活性［11］。从乳中分离的嗜冷菌所分泌的蛋白酶在pH=7缓冲液中的热稳定性见表1。

表1　乳源嗜冷菌分泌的蛋白酶在缓冲液中的热稳定性（pH=7）Table 1Thermal stability of the protease secreted by psychrophile in milk（pH=7）

纯化后的蛋白酶在乳中比在水中具有更高的稳定性，原因可能为乳中含有一定的可溶性钙。Daniel等指出大约0.38 mg/mL（～9.5 mmol/L）Ca2+可以通过阻碍蛋白分子表面局部环的暴露和敏感性而对蛋白酶的热稳定性具有保护作用，减少热失活过程中的自我降解；Ca2+也可通过蛋白分子多肽链之间远端配位体的相互交联（类似二硫键的作用），使整个分子的结构稳定［17］。

另外，与在高温时具有热稳定性相比，多数嗜冷菌产生的胞外蛋白酶对40℃～70℃左右的热处理非常敏感，这种现象被称为低温失活。Stepaniak指出假单胞菌蛋白酶在55℃的D值只有0.6 min～1.1 min［18］。分析原因可能是酶分子间的自我分解，即无活性的非折叠状态的酶分子被天然构象处于折叠状态、有蛋白水解活性的酶分子所分解，引起低温失活现象。在温度大于70℃以后，随着温度的升高，由于肽键水解、二硫键的随机配对、氨基酸残基被破坏、Maillard反应，被破坏降解的肽与乳清蛋白凝聚而沉淀，以及不正确构象的产生等原因可使酶失活速率加快［19］。

2.2乳中嗜冷菌蛋白酶的测定方法

Hull早期通过福林-酚法测定乳中酪氨酸或色氨酸的增加量来测定蛋白酶含量［20］。

琼脂扩散法是检测乳中蛋白酶的简便方法：用加有特定指示剂的琼脂制成平板后打孔，将嗜冷菌的细胞上清液加入孔中，通过测定孔周围透明圈的大小来测定上清液中蛋白酶的活性。其中，脱脂乳琼脂是最常用而有效的方法，该方法不足之处是灵敏度稍低［21］。

荧光胺、硝基苯、邻苯二甲醛等试剂可用来检测氨基酸的变化而测定蛋白酶［22-23］。Hockney等对福林-酚法、琼脂扩散、280 nm吸收和茚三酮法测定乳中嗜冷菌蛋白酶活性进行了比较，发现这些方法都检测不到低水平含量的蛋白酶活性，福林-酚法也仅检测到3×10-7kat/mL的活性，同时指出当乳中添加50 cfu/mL～500 cfu/mL嗜冷菌时，放置11 d～13 d发现蛋白酶量呈现曲线增多［24］。

Bendicho以干酪素为底物，检测乳中荧光假单胞菌产生的蛋白酶。原理为Azocasein在蛋白酶的作用下释放发色团，其在345 nm处具有最大吸收，进而测定嗜冷菌蛋白酶活性。该方法测定原料乳中的蛋白酶活性时一般需要添加叠氮化钠（0.5 g/L）抑制细菌生长［25］。

Dupont等采用纤溶蛋白酶IgG单克隆抗体的方法检测脱脂乳中纤溶蛋白酶的活性，于37℃下反应5 h［26］。该方法存在一定的缺陷，不能区分所测的酶活性是源于有活性的酶，还是源于钝化的酶，而使检测结果偏高。

Matta等采用杆菌蛋白酶IgG单克隆抗体22.5℃、3.5h～6.5h检测缓冲液或乳中蛋白酶［27］；采用Pseudomonas AFT-36蛋白酶的多克隆抗体检测缓冲液中或乳中的细菌蛋白酶，22.5℃、85 min可检测出酶活性［28］。

王辉等研究了牛乳中嗜冷菌数与其产生的耐热胞外蛋白酶活性的相关性。指出牛乳中单一嗜冷菌数与蛋白酶活性呈一定正相关，回归方程为Y= 0.454 8ln（x）+0.417 8，R2=0.817 2，差异极显著（P＜0.01）。自然状态下，原料乳在不同条件下贮存，嗜冷菌数有明显的增加趋势，但自然存放条件下，原料奶中嗜冷菌数和蛋白酶活性之间没有相关性［29］。此外，由于蛋白质水解产物的标准品问题，反向高效液相色谱和荧光分光光度计在乳中蛋白酶活力检测的应用具有局限性［2］。

3乳中嗜冷菌产生的耐热脂肪酶

3.1乳中嗜冷菌产生的脂肪酶的耐热性

牛乳中的微生物脂肪酶主要来源于嗜冷菌，其显著特征为耐热性，尤其是具有在UHT乳中存活的特性。大多数细菌脂肪酶属于胞外脂肪酶，产生于细菌生长的对数生长期后期和稳定生长期的前期，最适pH在7～9之间，分子量在30 ku～50 ku，在sn-1和sn-3位有特异性。细菌脂肪酶的三级结构是一个共同的折叠模式，称为α/β水解酶折叠，折叠有一个亲核的氨基酸顺序（丝氨酸、半胱氨酸或者天门冬氨酸），一个酸性催化残基（天门冬氨酸盐或谷氨酸盐）和一个组氨酸残基。亲核丝氨酸存在于活性中心的五肽顺序中（五肽顺序为gly-X-ser-X-gly）［2］。

假单胞菌属是牛乳中降解脂类的主要菌群，该菌脂肪酶存在ser活性部位，氨基酸序列与牛乳的脂蛋白脂肪酶不同。同时气单胞菌属、无色杆菌属、黄杆菌属等也能分泌脂肪酶。多数杆菌脂肪酶在60℃～75℃具有最大活性，而假单胞菌在30℃～45℃具有最大活性。不同嗜冷菌分泌的脂肪酶耐热性不同，黄杆菌分泌的脂肪酶与假单胞菌和气单胞菌分泌的脂酶相比较具有较差的耐热性。

Law等将提取的不同脂肪酶经63℃、30 min加热后活性为原来的55%～100%［30］。Champagne指出假单胞菌属可产生耐热的蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶，在巴氏杀菌过程中基本不受影响，即使在140℃、2 min的处理后，仍然会有10%的残留［31］。Andersson等指出脱脂乳中P.fluorescens SIK W1脂肪酶在100℃的D值为23.5 min，t1/2为7 min［32］；研究进一步指出同一细菌既能产生脂肪酶，也能产生蛋白酶，但是在乳粉长期贮藏时脂肪酶的热稳定性较蛋白酶要高［33］。

3.2乳中脂肪酶活力测定方法

测定不同体系中脂肪酶活力的方法大致分为：滴定法［34］、4-甲基伞形酮荧光测定法［35］、液相色谱法［36］、分光光度法［37］、层析法［38］、酶法［39］、以Br，CL-吲哚氧基辛酸盐为底物的试纸条检测法［40］和量热法［41］等。Choi提出应用脂肪酶水解脂肪产生的脂肪酸来测定脂肪酶活性，该方法简便、省时、药品使用量少，并可同时测定多个样品，而且直观性强，适于定性分析，但是该方法在定量描述上缺乏一定的准确度［42］。荧光测定法检测牛乳中脂肪酶活力耗费时间长，样品准备繁琐、仪器复杂，因此不作为快速鉴定的方法。Kannappan用高效液相色谱法对不同嗜冷菌产生的脂肪酶进行测定，这种方法适合于对底物具有专一性的酶的分析，并且灵敏度高，但设备昂贵［36］。Richardson等以三丁酸甘油脂为底物，根据反射比色法检测样品浊度和pH的变化来检测脂肪酶的活力，此种方法适用于检测脂肪酶浓度高的样品［37］。Blake用对硝基苯酚辛酸盐比色法测定荧光假单胞菌产生的脂肪酶活力，此方法操作简单，灵敏度高，检测时间为10 h［38］。

由于乳中嗜冷菌数量少，因此产生的耐热性脂肪酶含量也少，同时由于检测方法或是冗长费时，或是检测成本高、或是特异性强而难以实现，所以这些方法应用于乳体系中脂肪酶检测过程中都具有一定的局限性。近年来国内外测定乳中嗜冷菌脂肪酶时主要采用对硝基苯酚分光光度法，该方法测定乳中脂肪酶的原理是脂肪酶在一定条件下水解硝基苯酚酯，释放出具有黄色的物质对硝基苯酚，此物质在405 nm处对光有最大吸收，通过测定对硝基苯酚的吸光值，从而得到脂肪酶的活力。Humbert采用测定脂肪酶活力时为消除浊度对吸光度的影响，使用澄清剂溶解乳中酪蛋白胶粒和脂肪球，省去了萃取和离心的繁琐步骤，使检测方法更加方便快捷［39］。Stead提出脱脂乳经离心处理后脂肪酶会有一定的损失，可能是由于脂肪酶与乳中的酪蛋白有一定的结合引起的［40］。Bendicho改进了分光光度法，使得最低检测量为9.31 mU/mL，提高了检测速度及灵敏度［41］。此外，靳磊指出单一嗜冷菌数与脂肪酶活性呈一定正相关，回归方程为Y=0.013 3x+1.069，R2=0.712 7［42］。张树利指出脂肪酶活性与嗜冷菌的相关系数为0.746 9［43］。然而，这种相关性的建立基础是为了基于脂肪酶的活性评估嗜冷菌的数量，同时乳体系的菌属复杂，相关模型需要进一步验证。

4结论与展望

乳中嗜冷菌产生的蛋白酶和脂肪酶是一种反映嗜冷菌污染程度的指标，同时嗜冷菌分泌的耐热酶也是乳品科学领域努力攻克的难题。目前国内主要是通过控制牛体、奶站环境、挤奶器具、储奶和运奶器具的卫生来控制原料乳中嗜冷菌的生长，从而控制其耐热性酶的分泌。可见，原料乳中嗜冷菌的快速、准确、便捷的检测，将对乳制品中耐热酶的活性控制及产品的品质提高具有重要意义。

虽然目前对从乳中分离出的嗜冷菌所分泌的蛋白酶、脂肪酶的数量及酶活性影响因素有一定研究，但是这些耐热酶的精确的耐高温机理还不清楚，有必要探讨嗜冷菌分泌耐热酶与普通酶的构象差异，从而确定嗜冷菌分泌的胞外酶的独特耐热结构。同时，要针对耐热酶的控制方法进行系统、深入研究，研究中可以考虑嗜冷菌耐热酶的低温失活现象来抑制酶活性，也可以采取物理或化学的方法抑制耐热酶发挥作用，从而最大限度地减少因嗜冷菌耐热酶引起乳制品的腐败变质而产生的经济损失。

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Comparing Detection Methods for Extracellular Thermostable Enzymes Secreted by Psychrophile in Milk

WANG Wei-jun1，LI Yan-hua2
（1.Beingmate Baby&Child Food Co.，Ltd.，Hangzhou 311106，Zhejiang，China；2.College of Food Science and Biotechnology，Zhe Jiang Gong Shang University，Hangzhou 310018，Zhejiang，China）

Extracellular protease and lipase could be secreted by psychrotrophic bacteria in dairy products. These enzymes directly influenced the quality of dairy products.The study described the species of psychrophile isolated from milk，pointing out that pseudomonas fluorescens were the main strains which could metabolize protease and lipase.Thermal stability of these enzymes was elaborated and the methods of detection them were compared.It was expected to provide theoretical thoughts to predict the amount of contaminated psychrophile in dairy and dairy products，online detect and control the activity of thermostable enzyme and improve the quality of dairy products.

milk；psychrophile；protease；lipase；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.021

2014-01-01

王伟军（1979—），男（汉），博士，研究方向：乳品科学。