蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性与菌株毒力关系的研究

陈大福　王吉州　梁　勤

（福建农林大学蜂学学院，福州350002）

蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性与菌株毒力关系的研究

陈大福王吉州梁勤

（福建农林大学蜂学学院，福州350002）

为了探讨蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）胞外蛋白酶活性（PU）与其毒力的关系，评价胞外蛋白酶活力作为毒力指标的可靠性。本研究测定了9个不同来源地的蜜蜂球囊菌菌株的胞外蛋白酶活性及接种后各日累积蜜蜂幼虫死亡率和致死中时（LT50），将胞外蛋白酶活性与接种后各日累积死亡率及致死中时（LT50）进行回归分析，以确定胞外蛋白酶活性与其对蜜蜂幼虫的毒力间的相关性。结果表明各菌株胞外蛋白酶活性与其毒力间的存在显著相关性。因此，蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性可作为大量菌株筛选的参考毒力指标，但不能作为测定相关性的唯一指标。

蜜蜂白垩病；蜜蜂球囊菌；胞外蛋白酶活性；毒力

蜜蜂白垩病（bee chalkbrood disease）是由蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis Olive&Spiltoir）引起的蜜蜂幼虫的真菌性传染病［1］，具有很大的致病性和危害性。因此，诊断白垩病并对其加强防治，是发展养蜂业中需要紧迫解决的问题。目前国内外对蜜蜂球囊菌的研究主要集中在病原的生物学特性［2，3］、最适培养条件［4，5］、发病流行规律［6-9］、病理学［10］、病情的诊断［11］等方面，但较少涉及蜜蜂球囊菌的蛋白酶特性及其毒力方面的研究。

有关胞外酶的研究，国内外主要涉及有球孢白僵菌、绿僵菌、曲霉、黄杆菌、芽孢杆菌［12］等，蜜蜂球囊菌的胞外蛋白酶特性也有研究报道［13］，但其毒力研究却鲜见报道。本研究通过测定蜜蜂球囊菌不同菌株蛋白酶活性，分析其与毒力的关系，进而分析评价胞外蛋白酶活力作为毒力指标的可能性，进一步完善蜜蜂白垩病的基础研究，也可为有关蜜蜂球囊菌致病机理方面的研究提供一定的帮助。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株：本试验共使用了9个由福建农林大学蜂学学院蜜蜂分子生物学实验室自行采集、分离和保藏的蜜蜂球囊菌菌株，采集地及编号如表1。

表1　菌株采集地及编号

1.1.2酶诱导培养基：含1%明胶（W/V），NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O三种基盐各0.3 g/L。

1.1.3基质液的配制：1.0 mmol/L氮-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺，该化合物10 mg加入16 ml二甲基亚砜中即成。

1.2方法

1.2.1蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的培养

各菌株胞外蛋白酶通过摇床震荡诱导培养而获得。以2 ml孢子悬浮液（孢子浓度分别为106个/ml、107个/ml）接种，在35±0.5℃下震荡（180 r/min）培养5 d。培养物经4次过滤，滤液置于4℃待酶活性测定。

1.2.2胞外蛋白酶活性的测定

参照Bidochka&Khachatourians［14］和冯明光［15］的方法，略有改变进行测定。10 ml玻璃试管内装0.1 mol/ L Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）1.8 ml和培养物滤液100 μl，再加入100 μl基质液混匀，在35±0.5℃下往复式摇床震荡（180 r/min）培养20 min，然后移至35±0.5℃水浴2 min。每只试管中取100 μl液样，在OD410下分别测定吸收率。每株菌重复3次。混合液中基质被利用1.0 μmol/min即为1个标准蛋白酶活性单位（PU）。

1.2.3菌株毒力的测定

各菌株在PDA+酵母膏培养基上（35±0.5℃）培养5～8 d，用无菌水制备孢子浓度分别为106个/ml和107个/ml的悬浮液。用细铁丝框（10×10 cm）选取2日龄幼虫区标记100巢房。每巢房内滴入（5 μl）微量孢子悬浮液为处理组。逐日观察、记录处理组的标记100房区域的封盖前幼虫死亡数目，直到幼虫封盖，封盖后记录空房数目、被咬房的数目。观察病虫，确定其死因，统计蜜蜂球囊菌致死率。每组菌做3个平行试验，用无菌水做对照组试验。

1.2.4相关性分析

通过对胞外蛋白酶活性的测定，比较9株蜜蜂球囊菌间胞外蛋白酶活性差异。分析不同菌株对试虫的死亡率，观察开始死亡的天数，做出其累积死亡率曲线。然后根据几值分析法分析［16］各菌株间的毒力差异，计算真菌的LT50（致死中时）的平均值。

植物内生菌用于果蔬采后病害防治时，需要注意很多问题。由于植物内生菌本身也是微生物，是否对果蔬采后生理造成一定影响，是应用过程中需要考虑的因素；利用菌体防效的内生菌菌体易受外界环境影响，导致防效不稳定；大多内生菌是利用抗菌活性成分防治病菌的，由于发酵周期长与活性成分少，提取纯化技术不成熟等因素，使植物内生物菌生物保鲜剂多处于分离筛选和鉴定阶段，防效实验只局限在实验室，成果转化和应用率低。

用各菌株的PU测定值分别对试虫的死亡率或LT50进行回归分析，从而评价PU作为毒力指标的意义。

2　结果与讨论

2.1胞外蛋白酶活性的测定

9个菌株的胞外蛋白酶活性略有差异。其中，孢子浓度为106个/ml蛋白酶培养液中，浙江嘉兴ZhJ号菌株胞外蛋白酶酶活最高，福建ND-1号菌株最低；孢子浓度为107个/ml蛋白酶培养液中，甘肃GS-46号菌株胞外蛋白酶酶活最高，福建ND-1号菌株最低（图1）。可以看出，随着孢子数目的增大，胞外蛋白酶活性随之增大。菌株受环境、来源地的不同，胞外蛋白酶活性也存在差异性。

图1　胞外蛋白酶活性的测定

2.2菌株毒力的测定

不同菌株对试虫的致死率如图2、图3所示，试虫一般接种后3 d开始死亡，菌株间存在差异，蜜蜂球囊菌引起的死亡主要发生在接种后的5～11 d，毒力较弱的菌株为ND-1，较强的为GS-35。试虫在接种后10～11 d死亡率已基本稳定。比较而言，随着孢子数目的增多，各菌株对试虫的致死量相对增大，致死率高；孢子浓度为106个/ml接种11 d后蜜蜂幼虫死亡率仍低于50%（图2），孢子浓度为107个/ml接种9 d后蜜蜂幼虫死亡率均超过50%（图3）。

2.3蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性与菌株毒力相关性

根据回归分析结果（表2），不同菌株胞外蛋白酶活性水平与蜜蜂幼虫接种处理后3～17 d的累积死亡率均显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01），与LT50显著负相关，表明胞外蛋白酶与毒力有关联。但胞外蛋白酶活性与累积死亡率回归分析的r2的变动范围是0.0253～0.4440，即胞外蛋白酶活性对累积死亡率的贡献最大只能达到44.40%。说明胞外蛋白酶活性虽然可以作为菌株毒力的参考指标，但其参考价值有限。因此，用胞外蛋白酶活性测定完全替代常规毒力生物测定是不能达到满意效果。

图2　接种蜜蜂球囊菌9个不同菌株孢子悬浮液（孢子浓度为106个/ml）后蜜蜂幼虫的累积死亡率

表2　蜜蜂球囊菌不同菌株胞外蛋白酶活性与蜜蜂幼虫接种后不同时间累积死亡率及LT50的回归分析

图3　接种蜜蜂球囊菌9个不同菌株孢子悬浮液（孢子浓度为107孢子/ml）后蜜蜂幼虫的累积死亡率

2.4讨论

各个菌株的LT50的平均估计值是6.92～9.04 d，菌株间毒力差异很大。作者认为由于菌株的来源地不同，菌株间生物学势必存在差异，且受多方面因素的影响，致使蜜蜂球囊菌对蜜蜂幼虫的致病力存在差异。蜜蜂球囊菌在蜜蜂幼虫3～4日龄最易感染白垩病，孢子的萌发需要厌气条件，而菌丝的生长需要好气条件，故而3～4日龄幼虫的肠道厌气时间短，适合病原菌的生长特性。患白垩病的幼虫在封盖后的头两天或者前蛹期死亡，本研究所用的9个菌株均有相似的表现。接种后5～11 d蜜蜂幼虫大量死亡，呈现直线上升趋势，对于强毒菌株，在接种后11 d死亡率基本稳定下来。胞外蛋白酶的分泌和作用于寄主的主要阶段，应是在病菌穿透寄主体壁的侵染期。酶活性强的菌株，理论上穿透体壁的时间短，成功侵染率高［15］。这是酶活性作为蜜蜂球囊菌毒力参考指标的生物学基础，也是其接种后9 d死亡率与胞外蛋白酶活性相关的直接原因。

本研究发现不同菌株胞外蛋白酶活性水平与蜜蜂幼虫接种累积死亡率均显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）正相关，与LT50显著负相关，表明胞外蛋白酶与毒力有关联。由于蛋白酶仅仅是昆虫体壁结构物降解酶系之一，除此之外，与体壁结构降解物有关的其他酶系还包括几丁质酶、肽酶、酯酶等，并且蛋白酶和毒力之间的相关性众说纷纭，目前尚缺乏确定各酶之间关系的系统研究。所以作者认为还需要通过大量的毒力实验及数据分析方法的改进来进一步明确胞外酶活性与菌株毒力之间的关系。目前蜜蜂球囊菌对蜜蜂幼虫体壁的侵染机理还不是十分明确，而蜜蜂球囊菌侵染机理对其毒力相关性研究尤为重要，这些都是我们在下一步研究中需给予关注的。

［1］陈大福，梁勤.蜜蜂白垩病的研究进展［J］.蜜蜂杂志，2001（1）: 3-4.

［2］陈淑静，康雪冬，冯峰.蜜蜂白垩病研究初报［J］.中国养蜂，1994（6）:4-7.

［3］Gilliam M，Lorenz B J，Richardson G V.Factors affecting development of chalkbrood disease in colonies of honeybees［J］.Apidologie，1988（52）:314-325.

［4］梁勤，陈大福，王建鼎.温度、相对湿度和pH对蜜蜂球囊菌孢子萌发的影响［J］.应用生态学报，2000，11（6）:869-872.

［5］梁勤，陈大福，王建鼎.营养生态条件对蜜蜂球囊菌生长及产孢的影响［J］.中国生态农业学报，2001，9（4）:31-34.

［6］时丽君.蜜蜂白垩病发病规律及防治措施［J］.吉林畜牧兽医，2003（12）:45-46.［7］余林生，孟祥金.蜜蜂白垩病的病原和防治技术研究［J］.中国兽医科技，1999，29（12）:6-8.

［8］范正友.蜜蜂白垩病流行病学研究进展［J］.中国养蜂，1996，32（1）:15-16.

［9］张华瑞.试述蜜蜂白垩病的流行特点与致病因素［J］.养蜂科技，1994（4）:16-17.

［10］Chorbiński P.The development of the infection of Apis mellifera larvae by Ascosphaera Apis［J］.Electronic Journal of Polish A-gricultural Universities.Veterinary Medicine，2004，7（2）:5-12.

［11］James R R.Skinner J S.PCR diagnostic methods for Ascosphaera infections in bees［J］.Invertebr Pathol，2005，90（2）:98-103.

［12］Kreger de Moraes C，Schrank A，Vainstein M H.Regulation of extracellular chitinase and proteases in the entomopathogen and acaricide Metarhizium anisopliae［J］.Curr Microbiol，2003，46: 205-210.

［13］李飞雄，李江红，梁勤，等.蜜蜂球囊菌几种胞外蛋白酶的特性［J］.中国农业科学2011，44（6）:1247-1254.

［14］Bidochka M J，Khachatourians G G.Production and use of biological pest control agents［J］.Appl.Environ.Microbiol.，1987，53: 1679-1684.

［15］冯明光.胞外蛋白酶和脂酶活性作为球孢白僵菌毒力指标的可靠性分析［J］.微生物学报，1998，38（6）:461-467.

［16］丁珊，汤坚，丁贵银，等.球孢白僵菌血清学的初步研究.见中国虫生真菌研究与应用（第2卷）［M］.北京:中国农业科学出版社，1991，109-112.

Study on a correlation between the activity of extracellular protease from Ascosphaera apis and its virulence

Chen Dafu Wang Jizhou Liang Qin
（College of Bee Science，Fujian Agriculture&Forestry University，Fuzhou 350002，China）

The correlation between the activity of extracellular proteases from Ascosphaera apis Olive&Spiltoir and its virulence was studied to evaluate for the reliability for extracellular proteases activity level to be used as a virulence index.The activity of extracellular proteases，the daily cumulative mortality of honeybee larva inoculated by A. apis，and LT50of 9 strains of A.apis from various regions in China were assayed，respectively.Correlations of extracellular proteases activity to the daily cumulative mortality after inoculation and to the LT50's were revealed by the regression analysis.Regression analysis revealed that PU was significantly correlated to the virlence of A.apis.PU can be used as virulence index only for early-stage selection of candidate isolates in large quantity and isn't the only index of correlation to the virulence assay of A.apis.

bee chalkbrood disease；Ascosphaera apis；activity of extracellular protease；virulence

福建省自然科学基金项目（2011J01068）；国家蜂产业技术体系专项资金（CARS-45-KXJ7）资助

陈大福（1973－），男，博士，副教授，主要从事蜜蜂疾病研究，E-mail：dfchen826@163.com

梁勤，E-mail：lq-fz@163.com