ELISA操作注意事项及不确定度分量分析

张伟傅溥博高宏伟魏海燕梁新苗刘建礼刘来福*

（1.北京出入境检验检疫局 北京 100026；2.山东出入境检验检疫局）

ELISA操作注意事项及不确定度分量分析

张伟1傅溥博1高宏伟2魏海燕1梁新苗1刘建礼1刘来福1*

（1.北京出入境检验检疫局 北京 100026；2.山东出入境检验检疫局）

对ELISA的具体操作过程进行了梳理，讨论了操作过程中的注意事项。根据测量不确定度规范性文件的要求，结合要素的注意事项对ELISA检测过程中的不确定度分量进行了初步分析。

ELISA；注意事项；不确定度

1 前言

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA）是目前在很多领域广泛应用的一种试验方法，其基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。依其测定抗原和抗体的不同，ELISA可分为直接法、间接法、双抗体夹心法（直接、间接）、竞争抑制法（直接、夹心等）、捕获法等。在测定抗原时，蛋白质大分子抗原测定多用双抗体夹心法，而只有单个抗原表位的小分子则常使用竞争抑制法；对抗体的测定通常使用间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法和捕获法等［1］。在实际操作过程中，ELISA会出现一些常见的问题，问题的产生涉及试剂的选择、操作流程及不当操作等。本研究从ELISA检测的常见的问题出发，系统梳理影响ELISA试验结果的因素，根据测量不确定度规范性文件的要求与指南的指导对ELISA测定中的不确定度分量进行了归纳与分析。

2 ELISA检测中常见的问题分析

ELISA方法具有敏感度高、特异性强、自动化程度高等诸多优点，但此方法操作步骤较多，对实验室环境、温度、人员操作有较高要求，试验过程中每个操作环节不规范都会对试验产生影响，得到错误结果［2］。

2.1试剂

试剂本身以及在使用过程中的问题都会导致试验结果不准确，造成结果偏差。如，使用过期试剂或不同试剂盒组分混用；试剂盒未按规定保存或保存温度较高；标准品中可能不含强阳性标本；厂家试剂质量的变化等［3］。试剂、样品用前未平衡至室温；蒸馏水质有问题；待检样品放置时间过长或受到污染；试剂在使用过程中受到污染或反复使用；浓缩洗涤液使用时有结晶，未完全溶解；标记物使用不正确或者已经变质；移液吸头重复使用、未洗净或消毒不完全等。

2.2加样

加样过程中的错加、漏加试剂，或底物加量不足、顺序颠倒，或混合后加入；移液器计量不准，吸头内水分太多或不清洁；样品离心不完全；反应孔内发生凝血或残留细胞成分；加样时交叉污染；样品数量较多，加样时间过长，加样后未混匀等。这些情况会出现白板（显色步骤结束后，酶标反应板所有孔均无显色）、显色弱、灵敏度低、假阳性、重复性差等现象。

2.3温育

在温育过程中，培养箱温度过高或过低；温育时未按要求贴封片或加盖，使样品或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；人为延长或缩短样品在培养箱中的温育时间，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。这些情况会出现显色弱（高）、灵敏度低（高）、重复性差等。

2.4洗板

洗涤液添加过多，使孔与孔之间的液体交叉混合，造成反应板的污染；洗涤液用量不足或稀释倍数不符合要求，洗涤时冲击力太大，浸泡时间过长或不够；反应板数量过多造成洗板等待时间长（在室温较高时），人为地增加了反应时间；洗液量不足；洗板针堵塞，抽吸不完全：洗板不畅等［4］。这些情况会出现白板、显色弱（高）、灵敏度低（高）、假阳性、重复性差等现象。

2.5读板

读板时如果仪器参数设定不正确，滤光片不匹配，计算公式不正确，板底不清洁，酶标仪重复性差等，会导致灵敏度低、假阳性、重复性差等现象［5］。

2.6操作不当

任何不当操作都会影响结果。

2.7本底偏高及假阳性产生

在ELISA检测过程中，本底偏高甚至造成假阳性的结果是比较严重的问题。这主要可能是由以下几种原因造成：样品分离不完全；样品严重溶血或脂血；加样时间过长；样品与稀释液未充分混匀；酶标抗体（抗原）吸附于孔壁或表面；反应与显色时未加盖封口膜；温育时间（反应时间、显色时间）过长或温度过高；洗涤液污染或洗涤不彻底；工作环境温度过高。

2.8本底偏低及假阴性产生的原因

本底偏低及假阴性产生的原因主要包括：试剂未平衡至室温；加样量不足或样品过度稀释；加样时有气泡；抗原、抗体反应时间或显色时间不够；过度洗涤；环境温度过低；试剂盒过期等。

综上所述，ELISA检测技术是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断客观等，已广泛应用在各领域的免疫学检验中。然而，在ELISA操作过程中，常会因试剂、样品及操作技术等可控因素而影响结果的判读。因此，在试验操作中，操作者必须熟练掌握其基本操作，严格进行试剂、样品的核查，以确保检查结果的准确性和可靠性。只有加强各个环节的质量控制才能充分发挥其方法学的优点，保证检测结果的可靠性。

3 ELISA测定中不确定度分量的确定与分析

ELISA的主要操作过程：样品准备（含溶液配制、稀释等操作））→ELISA检测（标准品校准、阴性对照、阳性对照、加样、温育、计时等）→酶标仪读数→结果计算。

根据操作流程，结合操作注意事项的分析，按照测量不确定度规范文件的要求及应用具体指南中的分析要点，分析ELISA测定中不确定度的分量，如图1所示。

图1　不确定度分量的主要构成

ELISA测定中不确定度的来源主要由以下要素构成：

移液器（包括体积校准和温度校准）、酶标仪、温育温度、温育时间、重复性、阳性对照（包括吸光度值、平均值、体积及浓度）、阴性对照（包括吸光度值、平均值、体积及浓度）、样品（包括吸光度值、平均值及体积）、液层厚度、底物体积、终止液体积等。

根据《测量不确定度的要求》、《测量不确定度表示指南》、《测量不确定度要求的实施指南》、《检测和校准实验室能力的通用要求》、《测量不确定度评定与表示》等指导性文件的计算和统计要求［6-11］，结合国内外的ELISA测量不确定度的分析方法，本文选取阳性对照吸光度值P进行分析，以期为ELISA检测不确定度的研究提供分析思路与方法［12-19］。

P是指在某个特定波长下的吸光度值，根据朗伯-比尔定律（A=εbc），吸光度值与吸光系数（ε），液层厚度（b）和阳性质控对照液浓度（C0）成正比。对于某一特定的显色反应来说，ε是个常数，因此P的不确定度主要由b和C0提供。

3.1液层厚度（b）

在ELISA试验中，吸收光从酶标板上方垂直通过液层，因此影响b的主要因素就是溶液层的最终体积，即100 μL底物溶液（V3）+100 μL终止液（V4）。由于在试验中使用的是同样的加样器，因此产生的不确定度是相同的，而影响加样器体积的不确定度主要因素是加样器的校准（C）和温度效应（T），它们都属于B类不确定度。

（1）C产生的不确定度u（C）

根据试剂盒说明书的要求，使用100 μL的加样器其准确度为±2%，按矩形分布处理，校准引入的标准不确定度为：u（C）=±2%/=1.15（μL）；

（2）T产生的不确定度u（T）

容量器皿的校准在20℃下进行，假设实验室的温度为20℃±4℃，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，按矩形分布100 μL加样器由温度效应引入的标准不确定度为：u（T）=100×4×2.1×10-4=0.084（μL）；

（3）V3引起的标准合成不确定度u（V3）

由于校准和温度效应是2个相互独立的分量，因此V3引起的标准合成不确定度u（V3）=

（4）V4所引起的标准合成不确定度u（V4）

同理由100 μL终止液（V4）所引起的标准合成不确定度u（V4）=u（V3）=1.153（μL）；

因为u（V4）和u（V3）是两个相互独立的两个分量，所以b的标准合成不确定度分量u（b）=

需要说明的是b的影响需要辨证地看，因为溶液体积变化的同时也会使溶液浓度发生变化，即体积增大，厚度增大，吸光度增大；同时浓度减小，吸光度下降。为了降低风险，浓度的影响可忽略。

3.2阳性对照液浓度（C0）

C0取决于阳性对照液量（V0）的大小，因此取决于100 μL加样器的准确度。同3.1，影响加样器的体积不确定度的主要因素是C和T，它们都属于B类不确定度。

u（C）=1.15（μL）；u（T）=0.084（μL）；

因此，u（V0）=u（V3）=u（V4）=1.153（μL）。

因为影响C0的仅有V0一个分量，因此C0的标准不确定度u（C0）=u（V0）=1.153（μL）。

3.3合成P的不确定度

因为b和C0是2个相互独立的分量，又是相乘的关系，根据公式：

对于P进行n次平行测定，其结果如表1所示。

表1　阳性对照（P）的n次重复测定结果

那么P的合成标准不确定度u（P）计算如下：

酶联免疫吸附试验过程复杂，涉及的不确定度的分量较多，每个分量都要根据自身特点进行分析与计算，形成合成不确定度。

4 结论

本研究结合具体的ELISA实际操作流程和关键环节，分析了ELISA检测中出现的主要问题及产生的原因，确定了ELISA检测过程中的不确定度分量。根据质量体系对测量不确定的要求，结合国内外的分析方法，选取阳性对照吸光度值P进行分析，以期为ELISA检测不确定度的研究提供分析思路与方法。

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Analysis of Operational Consideration and Uncertainty of ELISA

Zhang Wei1，Fu Pubo1，Gao Hongwei2，Wei Haiyan1，Liang Xinmiao1，Liu Jianli1，Liu Laifu1*
（1.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026；2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Afteranalyzing thedetailedoperatingproceduresofELISAmethodssystematically，the operational considerations of ELISA are discussed.According to the requirements of normative documents ofmeasurementuncertainty，thecomponentsofELISAuncertaintypreliminarilybasedonthe consideration factors are analyzed.

ELISA；Operational Consideration；Uncertainty

R446.61

E-mail：zhangwei.cau@163.com；*通讯作者E-mail：liulf@bjciq.gov.cn

国家质检总局科技计划项目（2013IK306）

2015-06-09