肿瘤坏死因子α与白介素17在银屑病中的表达

吴方毅任妮丽

肿瘤坏死因子α与白介素17在银屑病中的表达

吴方毅1任妮丽2*

目的： 检测TNF-α与IL-17在银屑病皮损中的表达。方法： ELISA检测68例银屑病患者与28例对照（非银屑病患者）血清TNF-α和IL-17的表达；免疫印迹法检测局部皮损、患者正常皮肤及对照者皮肤中TNF-α和IL-17的表达；qT-PCR检测TNF-α和IL-17的mRNA表达。结果： 银屑病患者血清TNF-α、IL-17的表达均高于对照组（P＜0.05）；皮损组织中TNF-α、IL-17蛋白及mRNA的表达均高于患者正常皮肤及对照组皮肤（均P＜0.05）。结论： TNF-α与IL-17在银屑病的发展中可能相互作用。

TNF-α； IL-17； 银屑病

银屑病的发病率约1～5%，1，2银屑病的病因还不完全清楚，普遍认为是一种自身免疫性的炎性疾病。银屑病的全基因组关联已经确定，这些关联的基因位点参与了皮肤的屏障功能（LCE3A，LCE3C和LCE3D）、T-细胞信号转导（IL-2，IL-17，IL-21，IL-13，IL-12B，IL-23A，IL-23R等）和抗原提呈（ERAP1和HLA-C）。3，4在这些因子中，细胞因子白介素-17在银屑病的发病机制中具有至关重要的作用。银屑病斑块显示活化的T细胞，特别是Th17型的浸润放大了炎性反应，活化的T细胞分泌的重要细胞因子包括IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-17，肿瘤坏死因子（TNF）-α，干扰素γ，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子和血小板介导的生长因子。5TNF-α是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，在异常情况下，特别是其水平升高时会导致免疫病理反应，如类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、炎性肠炎、克朗病等。新近研究发现，6银屑病患者皮损、血清、关节腔滑膜或细胞培养上清液中TNF-α的水平较正常对照组明显升高，经治疗后会有不同程度的下降，且银屑病患者病情严重程度与TNF-α的水平呈正相关，提示TNF-α在银屑病发病机制中有重要作用。IL-17和TNF-α的组合表现出复杂的相互作用与增强基质的形成，7碱性磷酸酶活性，并具有降低Schnurri-3表达的净效应。但两者在银屑病中的共表达及意义尚无相关研究。本文主要研究IL-17与TNF-α在银屑病中的共表达及意义。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 TNF-α抗体购自于 saierbio（货号：ReSRP00068），IL-17抗体购自于 BD（货号：559501），IL-17A ELISA试剂盒购自于Enzo（货号：ADI-900-177），TNF-αELISA试剂盒购自于Diaclone（货号：950.090.048）

1.1.2标本 收集我科2000-2013年经病理证实为银屑病的患者资料68例，其中男31例，女37例，年龄20～75岁，平均38岁，收集外周静脉血液标本，及背部或腹部破损的皮损组织（A组），取距皮损处大于12 cm的正常皮肤送检作对照（B组）。同期我院整形美容科门诊28例患者废弃的正常皮肤作为正常皮肤对照（C组）。收集的皮肤做液氮冷冻保存。收集的银屑病患者外周血液离心后取血清冷冻保存，同期体检门诊健康人群血常规血清液做健康对照。所有病例均有患者签字的知情同意书和有创操作同意书。

1.2方法

1.2.1运用ELISA检测循环血中TNF-α/IL-17的表达水平，采用人血清TNF-αELISA试剂盒以及人血清IL-17 ELISA试剂盒，450 nm紫外线下检测，8各种实验要求和步骤严格按照说明书进行，计算各样本TNF-α/IL-17蛋白数值乘以稀释倍数，取得TNF-α/ IL-17蛋白的血浆浓度。

1.2.2Western检测银屑病患者局部皮损组织、皮旁组织及正常皮肤组织中的TNF-α/IL-17表达将皮肤组织收集到的匀浆液进行免疫印记法9检测。TNF-α/IL-17抗稀释度分别为1∶400、1∶600。图像分析系统扫描分析各条带灰度值，结果取被检条带与内参条带的灰度值之比。

1.2.3运用qT-PCR检测银屑病患者局部皮损组织、皮旁组织及对照皮肤组织中TNF-α/IL-17的mRNA表达水平，剪绿豆大皮损样品，加入1 mL Trizol，匀浆器匀浆。加入200μL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5 min，12 000 rpm 15 min 4℃。转上层水相（约400μL）于新1.5 mL EP管中，加入400μL异丙醇，混匀，室温静置10 min，12 000 rpm 10min 4℃。弃上清，沉淀用预冷的70%无水乙醇洗3次，空气干燥5～10 min，溶于20μL DEPC水中。分光光度计测定RNA浓度。将所得到的cDNA做10倍稀释，取4μL进行逆转录，10Green/Flouresceinq PCR Master Mix（2X）10μL，H2O 5.2μL；DL2000：2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；Cycling conditions，40 cycles of 95℃-30 s，60℃-30 s。引物设计见表1：

表1　小鼠肺腺癌组织中ERβ、ERβ2和IGF-1R的FQ-PCR引物序列

1.2.4统计学方法 统计学分析采用SPSS 19.0软件。使用卡方检验分析TNF-α和IL-17在银屑病患者及对照组中表达的差异。银屑病患者血液及皮损组织中TNF-α和IL-17之间进行表达相关性分析。P＜0.05为差异有显著性统计学意义。

2　结果

2.1银屑病患者与健康人群循环血中TNF-α/IL-17表达水平的比较 采用ELISA试剂盒检测银屑病患者与健康人群循环血中TNF-α/IL-17表达，发现TNF-α/IL-17在银屑病患者血液中的表达均高于健康人群（表2，图1），表明TNF-α/IL-17在银屑病患者血液中存在共同高表达现象。

表2　不同人群TNF-α/IL-17表达水平的比较

图1　不同人群血液中TNF-α/IL-17表达的比较

2.2局部皮损组织、皮损旁组织及健康皮肤组织中的TNF-α/IL-17表达 运用Western-blot检测局部皮损组织、皮损旁组织及健康皮肤组织中的TNF-α/ IL-17表达，发现TNF-α/IL-17蛋白水平在皮损组织中显著高于皮损旁组织及健康皮肤组织（均P＜0.05），对照组与皮旁组织无统计学意义。表明TNF-α/IL-17存在相互作用的分子基础，在银屑病中炎症因子与TNF-α可能存在协同促进作用，见图2。

图2　不同人群不同组织TNF-α/IL-17蛋白水平的比较

2.3局部皮损组织、皮损旁组织及健康皮肤组织中的TNF-α/IL-17 mRNA的表达 为了在mRNA水平进一步研究局部皮损组织、皮损旁组织及健康皮肤组织中的TNF-α/IL-17表达，我们所取得的标本做TNF-α/IL-17的FQ-PCR分析。FQ-PCR结果发现TNF-α/IL-17分别在其局部皮损组织显著高于对照组和皮损旁组织（P＜0.05），对照组与皮旁组织无统计学意义。这些表达趋势与蛋白水平相一致，进一步表明TNF-α/IL-17存在相互作用的分子基础，见图3。

图3　不同人群不同组织TNF-α/IL-17 mRNA水平的比较（2-△△t=△t=实验组含量-内参含量；△△t为平均值，例如△△t（IL-8）=△t（IL-8）-△t（对照组）；2-△△t平均值=2-△△t，即2-△△t的平均值）

3　讨论

白细胞介素-17（IL-17A）属于六配位成员（IL-17A和IL-17F）促炎细胞因子，IL-17是该系列的原型。这种二聚体糖蛋白在循环中存在同型二聚体IL -17A或异源二聚体IL-17F。11-13在银屑病的发病机制研究中，无论是先天还是后天性免疫系统中所涉及的银屑病，过度增殖角质形成细胞是通过从T细胞的细胞因子驱动的，产生进一步的促炎性细胞因子。银屑病斑块显示活化的T细胞，特别是Th17细胞的浸润放大炎性反应，产生大量的IFN-γ，IL-17，IL-22和TNF-α。这显示出IL-17和TNF-α均在银屑病中具有重要作用。

在本实验中发现，银屑病患者循环血液中IL-17和TNF-α均高于对照组，并且在蛋白水平和mRNA水平同样显示出局部皮损组织中均高于皮旁组织及正常皮肤组织，说明IL-17和TNF-α在银屑病患者有显著高表达现象。一个更加关键的报道是14TNF-α抑制BMP2表达时增强了IL-17的分泌。TNF-α与IL-17共同激活NF-κB和AP-1，15，16IL-17上的hMSCs增加TNF-α的作用效率，14为此我们推测在银屑病中可能也存在这种交叉反应。

初步实验中我们发现IL-17和TNF-α在银屑病中均显著高表达，这表明两信号通路存在相互作用的分子基础。为了进一步研究IL-17和TNF-α在银屑病中是否具有相互作用，我们对比银屑病患者循环血液中IL-17和TNF-α的表达，并进行相关性分析，发现两者的表达具有相关性。在后续的免疫印迹实验和qT-PCR实验中也发现IL-17和TNF-α在银屑病患者皮损组织中的表达具有相关性，并且在局部皮损组织、皮旁组织及对照皮肤组织中表现出明显的梯度趋势。这些结果表明IL-17和TNF-α在银屑病进展中可能存在相互作用。

综上所述，本文初步探讨了银屑病患者循环血液及局部皮损组织中TNF-α/IL-17的表达，发现TNF-α/IL-17在银屑病患者显著高表达，且两者具有共表达趋势；TNF-α/IL-17在银屑病的进展中可能存在相互作用。由于本文只是初步探讨TNF-α/IL-17的表达，为研究两者在银屑病中相互作用的分子基础提供理论依据，尽管结果表明TNF-α/IL-17两信号通路可能存在相互作用，但是还不足以证实，这有待于下一步的深入研究，其结果可能为银屑病的多靶点联合治疗提供新的选择。

1Christophers E.Psoriasis--epidemiology and clinical spectrum. Clin Exp Dermatol，2001，26（4）：314-320.

2 Gelfand JM，Weinstein R，Porter SB，et al.Prevalence and treatment of psoriasis in the United Kingdom：a populationbased study.Arch Dermatol，2005，141（12）：1537-1541.

3Capon F，Burden AD，Trembath RC，et al.Psoriasis and other complex trait dermatoses：from Loci to functional pathways.J Invest Dermatol，2012，132（3 Pt 2）：915-922.

4Chen H，Poon A，Yeung C，et al.A genetic risk score combining ten psoriasis risk loci improves disease prediction.PLoS One，2011，6（4）：e19454.

5 Nickoloff BJ.The immunologic and genetic basis of psoriasis. Arch Dermatol，1999，135（9）：1104-1110.

6 Torres T，Bettencourt N，Ferreira J，et al.Influence of TNF-alpha gene polymorphisms in coronary artery calcification in psoriasis patients.JEur Acad Dermatol Venereol.2014.doi：10.1111/ jdv.12706

7Gradolatto A，Nazzal D，Truffault F，et al.Both Treg cells and Tconv cells are defective in the Myasthenia gravis thymus：roles of IL-17 and TNF-alpha.JAutoimmun，2014，52：53-63.

8 Long YY，Wang Y，Huang QR，et al.Measurement of serum antibodies against NY-ESO-1 by ELISA：A guide for the treat-ment of specific immunotherapy for patientswith advanced colorectal cancer.Exp Ther Med，2014，8（4）：1279-1284.

9Chang MM，Lovett J.A laboratory exercise illustrating the sensitivity and specificity ofWestern blot analysis.Biochem Mol Biol Educ，2011，39（4）：291-297.

10 Chueh FS，Chen YL，Hsu SC，et al.Triptolide induced DNA damage in A375.S2 humanmalignantmelanoma cells ismediated via reduction of DNA repair genes.Oncol Rep，2013，29（2）：613-618.

11 Gaffen SL.Recent advances in the IL-17 cytokine family.Curr Opin Immunol，2011，23（5）：613-619.

12 Zhang B，Liu C，QianW，etal.Structure of the unique SEFIR domain from human interleukin 17 receptor A revealsa composite ligand-binding site containing a conserved alpha-helix for Act1 binding and IL-17 signaling.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2014，70（Pt 5）：1476-1483.

13Wright JF，Bennett F，Li B，et al.The human IL-17F/IL-17A heterodimeric cytokine signals through the IL-17RA/IL-17RC receptor complex.J Immunol，2008，181（4）：2799-2805.

14Osta B，Lavocat F，Eljaafari A，et al.Effects of interleukin-17A on osteogenic differentiation of isolated human mesenchymal stem cells.Front Immunol，2014，5：425.

15 Kehlen A，Thiele K，Riemann D，et al.Expression，modulation and signalling of IL-17 receptor in fibroblast-like synoviocytes of patients with rheumatoid arthritis.Clin Exp Immunol，2002，127（3）：539-546.

16Shalom-Barak T，Quach J，Lotz M.Interleukin-17-induced gene expression in articular chondrocytes is associated with activation ofmitogen-activated protein kinases and NF-kappaB.J Biol Chem，1998，273（42）：27467-27473.

（收稿：2015-01-19）

·病例报告·

The common expression of TNF-αand IL-17 in psoriasis and its significance

WU Fang-yi，REN Ni-li.Department ofDermatology，Shiyan People'sHospital，Affiliated to Hubei University ofMedicine，Shiyan，442000

Objective：To detect the expression of TNF-αand IL-17 in the patientswith psoriasis.M ethods：The serum levels of TNF-αand IL-17 were detected in 68 patients with psoriasis and 28 controls from cosmetic surgery department.The expression of protein TNF-αand IL-17 in the patients'lesions and normal skin of the patients aswell as the skin of normal controlswas detected by ELISA and themRNA of TNF-αand IL-17 was detected by qT-PCR.Results：The levels of serum TNF-αand IL-17 were higher in the patients than in controls.The levels of protein and mRNA expression of TNF-αand IL-17 were higher in the patients' lesions than in thenormalskin of the patientsand controls.Conclusion：TNF-αand IL-17may be interacted in the progress of psoriasis.

TNF-α；IL-17；psoriasis

1湖北医药学院附属人民医院皮肤科，十堰，442000

2湖北医药学院附属人民医院医务科，442000