天然绿色棉色素组分的提取及性能研究

胡志华，马明波，何 肖，鲁 庚，周文龙

（浙江理工大学材料与纺织学院，杭州310018）

天然绿色棉色素组分的提取及性能研究

胡志华，马明波，何 肖，鲁 庚，周文龙

（浙江理工大学材料与纺织学院，杭州310018）

采用正相柱层析法分段富集绿色棉色素，用紫外-可见光谱分析富集组分的光谱特性，并研究富集组分对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）和2，2’-联氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS+·）两种自由基的清除能力。结果表明：正相柱对天然绿色棉色素具有更有效的分离效果，0%甲醇能富集到天然绿色棉色素中的黄绿色组分；绿色棉粗提色素及其分段富集组分都具有较好的DPPH·和ABTS+·清除能力。

天然绿色棉；色素；分离；抗氧化

0　引 言

天然彩色棉在加工使用过程中不需要经过化学漂染，在降低生产成本的同时也避免了对环境的污染［1］。用彩棉纤维加工的面料满足了消费者对服饰的自然生态、舒适、健康的需要［2］。然而，人们对天然彩棉纤维的了解还远远不够，只有通过深入的研究，开发其潜在的功能，才能拓宽其应用范围［3-5］。

有研究表明，天然绿色棉色素的主要成分含有多酚类物质［6-8］，而多酚类物质由于酚羟基的存在，大多具有一定的抗氧化性能。虽然纺织品的抗氧化性能不如其他性（功）能（如抗菌性能、防紫外性能和阻燃性能等）引人关注，但抗氧化性能的织物具有清除人体表皮的自由基的潜在功能，防止自由基造成的皮肤老化及抵抗力下降等伤害。为研究绿棉色素的抗氧化性，本研究采用柱层析法对绿色棉色素进行富集分离，以维生素C（Vc）为参照，考察各富集组分对DPPH·和ABTS+·两种自由基的清除能力。

1　实验部分

1.1实验材料与试剂

实验材料：天然绿色棉纤维（浙江省农业科学研究院提供）。

化学药品和试剂：柱层析用硅胶（100～200目，青岛海洋化工厂），二氯甲烷、甲醇和乙醇（分析纯，杭州高精精细化工有限公司），二氯甲烷和甲醇（色谱纯，阿拉丁试剂有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1绿色棉粗提色素

利用FZ-102微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）将绿棉纤维粉碎，然后以二氯甲烷/乙醇（体积比50/50）混合液为提取剂，浴比1∶50（g/ mL），在JK-3200DB超声波清洗机（合肥金尼克机械制造有限公司）中超声提取2 h，抽滤，在R201D型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）上将溶剂蒸干，获得粗提色素备用。

1.2.2绿色棉粗提色素的高效液相色谱（HPLC）分析

分别采用Agilent-1200反相高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）与Waters1525正相高效液相色谱仪（美国沃特斯公司）检测分析粗提色素的成分，正相检测条件：流动相A：CH2Cl2；流动相B：体积比为100∶15∶0.6的CH2Cl2、CH3OH和CH3COOH混合溶液，色谱柱Agilent Zorbax Rx-Sil（4.6×250 mm，5μm），流速0.8 m L/min，进样量10μL，检测波长320 nm，梯度洗脱：0～15 min，20%～60%B；15～25 min，60%～70%B；25～30 min，70%～100%B；30～35 min，100%～0B。反相检测条件：流动相A：甲醇；流动相B：0.03%三氟乙酸，色谱柱Agilent Zorbax Edipse XDB-C18（4.6×150 mm，5μm），流速0.8 mL/min，进样量10μL，检测波长320 nm，梯度洗脱：0～12 min，60%～100%A；12～22 min，100%A；22～26 min，100%～60%A。

1.2.3绿色棉色素组分的富集

将正相硅胶于110℃烘箱中烘1.5 h，然后将其缓慢倒入正己烷中，并搅拌，待混合均匀后，再填入预装有少量正己烷的层析柱中。在保证液面始终高于填料的前提下，用正己烷冲洗柱子，使填料填实。采用干法上样：色素粉末与适量硅胶混合，利用二氯甲烷/乙醇溶液溶解，然后将溶剂蒸干，缓慢加在层析柱中。洗脱剂采用二氯甲烷与甲醇的混合溶液，甲醇的体积百分比依次为0%、10%、30%、60%、100%，将溶剂蒸干备用。

1.2.4绿色棉色素组分的紫外光谱测定

将粗提色素与各富集的色素组分用适量二氯甲烷/乙醇（体积比50/50）溶液溶解，以二氯甲烷/乙醇（体积比50/50）为参照，用TU-1950紫外-可见分光光度计（北京谱析通用仪器有限公司）测试试样的紫外可见吸收光谱。

1.2.5绿色棉色素组分对DPPH·的清除

适当修改Gülc in clhami［9］的试验方法，以无水乙醇为溶剂配制0.1 mmol/L的DPPH·溶液，体积比1∶1的无水乙醇和二氯甲烷混合液溶解色素组分，备用。分别取1 mL浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.1 g/L粗提色素与各富集组分溶液，往其中加入2 mL的DPPH溶液和7 mL的二氯甲烷/乙醇（50/50）混合溶液。37℃恒温振荡30 min，测定517 nm处的吸光度，记作A样品。空白组测定方法为8 mL的二氯甲烷/乙醇（50/50）混合溶液中加入2 mL的DPPH溶液，37℃恒温振荡30 min，测定517 nm处的吸光度，记作A空白。为消除色素在517 nm处的可见吸收对实验的影响，设定对照组，测定方法为在1 mL的色素溶液中加入9 mL的二氯甲烷/乙醇（50/50）混合溶液，37℃恒温振荡30 min，测定517 nm处的吸光度，记作A对照。DPPH的清除率I的计算：

1.2.6绿色棉色素组分对ABTS+·的清除

适当修改Gülc in clhami的试验方法，配制ABTS+·溶液：先配制2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液，并以此来配制7 mmol/L的ABTS+·溶液，将该溶液室温避光放置12～16 h，在测试时需将ABTS+·溶液用0.1mol/L p H=7.4的磷酸盐缓冲液稀释，使其在734 nm处的吸光度在0.68～0.72之间。测试方法为在1 mL浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.1g/L的粗提色素与各富集组分溶液中分别加入10 mL的稀释之后的ABTS+·溶液，充分振荡，密封避光，6 min之后测试734 nm处的吸光度，记作A样品。空白组测定方法为1 mL的无水乙醇中加入10 mL的稀释之后的ABTS+·溶液，6 min之后测试734 nm处的吸光度，记作A空白。对照组测定方法为1 mL的色素溶液中加入10 mL的0.1 mol/L p H=7.4的磷酸盐缓冲液，6 min之后测试734 nm处的吸光度，记作A对照。ABTS+·的清除率I用式（1）计算。

2　结果与讨论

2.1绿色棉粗提色素的HPLC分析

图1为采用正相柱和反相柱进行天然绿色棉色素组分分离的HPLC图谱。图1显示，天然绿色棉色素由多种组分组成。采用反相柱对天然绿色棉色素分离已经有人做过探索［6］，其分离结果和本文一致；而采用正相柱进行天然绿色棉组分的分离此前还未见报道。从图1（b）中可以看出，采用正相色谱柱能分离检测到更多的色素组分。其中正相HPLC图谱中保留时间为20.5～24.0 min的组分和反相HPLC图谱检测到的组分一致，而正相HPLC图谱中保留时间在12.0～20.0min的一系列组分，并不能在反相HPLC中检测到。说明正相柱可以更有效地对天然绿色棉色素实施组分分离。因而本文采用正相柱层析法来分段富集绿色棉色素。

2.2绿色棉色素组分的紫外-可见光谱分析

绿色棉粗提色素及其各富集组分的紫外-可见吸收测试结果见图2。图2显示，粗提色素的最大吸收峰在228、242、293 nm和327 nm，与咖啡酸的紫外吸收曲线类似［10］，推测绿棉色素中可能含有咖啡酸的衍生物，与杨永林［7］的研究相吻合。绿棉色素及其各富集组分在紫外区的摩尔吸光系数远大于可见区，适当浓缩，发现在665 nm左右绿棉粗提色素及0%甲醇富集组分都出现一个吸收峰，说明粗提色素和0%甲醇富集组分具有蓝绿光显色特性［11］。0%甲醇富集组分在400 nm左右具有强的吸收，其吸收的形式不是锐峰而是肩峰的形式，具有黄色的显色特性，因而0%甲醇富集组分显示为黄绿色。10%、30%、60%甲醇富集组分在可见区的380～450nm波段都有一定的吸收，具有黄光的显色特性。而100%甲醇富集组在可见区都没有明显吸收，为无色或颜色较浅的组分。

图1　绿棉色素的HPLC图谱

图2　绿棉色素及其各富集组分的紫外-可见谱图

2.3绿色棉色素组分对DPPH·的清除能力

绿棉色素组分对DPPH·的清除能力的实验结果见图3。图3可见，富集到的组分都有一定的DPPH·的清除能力，但低于Vc。对DPPH·的清除能力由高到低分别是60%甲醇、0%甲醇、100%甲醇、30%甲醇和10%甲醇富集的色素组分。由于在对绿棉色素分段富集时死吸附严重，推测死吸附的成分中可能含有比粗提色素本身抗氧化性能更优异的成分。同时可以发现，在测试的质量范围内，色素质量与DPPH·清除率呈线性关系，其拟合线性方程见表1。以清除50%的自由基所需要的色素质量IE50这一指标来评估抗氧化性能，IE50越小，表明抗氧化活性越强。粗提色素的IE50为0.0356mg略高于Vc的0.0211mg，约是Vc的1.7倍，0甲醇富集组分的IE50约为Vc的2.5倍，10%甲醇富集组分的IE50约为Vc的7.4倍，30%甲醇富集组分的IE50约为Vc的6.4倍，60%甲醇富集组分的IE50约为Vc的1.7倍，100%甲醇富集组分的IE50约为Vc的4.3倍，虽然绿色棉各色素组分的抗氧化活性不如Vc的强，但也说明提取的绿棉色素组分均具有较优异的DPPH·清除性能。

图3　Vc和绿棉色素组分对DPPH·的清除率

2.4绿色棉色素组分对ABTS+·的清除能力

绿色棉色素组分对ABTS+·的清除能力实验结果见图4。图4显示，与清除DPPH·类似，富集到的色素组分均具有一定的ABTS+·的清除能力，但均略低于Vc。对ABTS+·的清除能力由高到低分别是60%甲醇、0%甲醇、100%甲醇、10%甲醇和30%甲醇富集到的色素组分。同样，在测试的质量范围内，色素质量与ABTS+·清除率呈线性关系，见表2。以IE50这一指标评估，粗提色素的IE50约为Vc的1.8倍，0%甲醇富集组分、10%甲醇富集组分、30%甲醇富集组分、60%甲醇富集组分、100%甲醇富集组分的IE50依次约为Vc的4.2、6.0、6.4、2.5、4.4倍，虽然绿色棉各色素组分的抗氧化活性不如Vc的强，但也说明富集到的绿棉色素组分均具有较优异的ABTS+·清除性能。

图4　Vc和绿棉色素组分对ABTS+·的清除率

表2　Vc和绿棉色素组分清除ABTS+·的线性拟合方程和lE50

3　结 论

利用正相色谱能更有效地检测分离天然绿色棉色素成分，0%甲醇富集到的组分在665 nm有吸收峰，说明该组分具有蓝绿光的显色特性，在400 nm左右具有强的吸收，其吸收的形式不是锐峰而是肩峰的形式，具有黄色的显色特性，因而该组分呈现黄绿色。绿色棉粗提色素及其分段富集组分都具有较好的DPPH·和ABTS+·清除能力，抗氧化性能略低于Vc。由于抗氧化实验后的溶液是包含有未被氧化的色素、被氧化的色素、未被还原的自由基、被还原的自由基的混合溶液，因此还无法对氧化前后的绿色棉色素组分的光谱特性进行研究。天然绿色棉色素组分的结构目前还没有定论，对于其抗氧化机理还有待进一步的研究。

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［11］杨子超.基础无机化学理论［M］.西安：陕西人民出版社，1985：314-316.Extraction of Naturally Green Cotton Pigment Component and Property Research

HU Zhi-hua，MA Ming-bo，HE Xiao，LU Geng，ZHOU Wen-long
（College of Materials and Textiles，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou，Zhejiang，310018，China）

In this paper，the extractions of green cotton pigment are segmented by using normal phase chromatography，and the spectral characteristics of enriched components with UV-VIS spectrum are analyzed.Besides，scavenging activities of free radicals DPPH·and ABTS+·are analyzed.The experimental result shows that normal phase column is more effective for the separation of pigment in green cotton；the yellowish green component can be enriched by the 0%methanol.Green cotton pigment and its segmented enrichment component have good DPPH·and ABTS+·scavenging activities.

natural colored cotton；green cotton；pigment；separation；antioxidation

TS102.2

A

1673-3851（2015）06-0757-04

（责任编辑：张祖尧）

2015-02-01

国家自然科学基金项目（51373156）

胡志华（1990-），男，江西新余人，硕士研究生，主要从事新型纺织材料与绿色纺织品的研究。

周文龙，E-mail：wzhou@zstu.edu.cn