固相萃取-高效液相色谱法测定角膜接触镜护理液中聚氨丙基双胍

北京市医疗器械检验所（101111）刘曦 崔永平

1 引言

双胍类物质是一种对细菌和病毒有较强杀灭作用的杀毒剂，其具有广谱抗菌、低浓度高效能、对眼睛和皮肤低刺激等特点，广泛应用于工业、农业、食品、医疗和个人护理等领域。目前，聚氨丙基双胍（PAPB）常用于角膜接触镜护理液中，该类护理液对角膜接触镜的杀菌消毒和抑制致病微生物的作用完全符合GB 19192-2003和YY 0719.3-2009的要求[1][2][3][4][5]。PAPB在角膜接触镜护理液中的含量约为1μg/mL，含量过低达不到杀菌效果；过高则会在接触镜上聚集对角膜或眼部其它组织产生刺激或伤害[6]。因此，卫生部规定消毒剂中有效成分的准确测定是检查消毒剂质量的基本措施之一；YY 0719.2-2009中也强制性要求接触镜护理产品应符合制造商标示的主要有效成分含量范围[7][8]。但行业标准中并未规定检验方法，国内外也鲜见相关方法学研究报告。鉴于此，本文利用Sep-Pak固相萃取柱对样品中PAPB进行富集，去除样品中基线噪音和杂质峰的干扰，采用液相色谱法建立角膜接触镜护理液中PAPB的测定方法，为此类产品的风险控制、安全性评价和行业标准的完善提供依据。

附表1 加标回收率实验结果

附表2 样品含量测定结果

附图1 PAPB标准工作液高效液相色谱图

附图2 相似浓度的PAPB标准工作液与样品检验液的高效液相色谱图

2 材料与方法

2.1 试剂与样品 磷酸（北京化学试剂厂，优级纯），盐酸（北京化学试剂厂，优级纯），己烷磺酸钠（国药集团化学试剂有限公司，纯度：99.0%），氢氧化钠（北京化学试剂厂，分析纯），四硼酸钠（北京化学试剂厂，分析纯），硼酸（西陇化工股份有限公司，分析纯），三乙胺盐酸盐（天津市光复精细化工有限公司，纯度：99.00%～100.5%），氯化钠（北京化学试剂厂，分析纯），甲醇（Fisher Scientific，HPLC Grade），PAPB对照品（批号：4/30/2014，纯度：98.9%），角膜接触镜护理液（批号：A131008，净含量：500mL）。

2.2 仪器设备 高效液相色谱仪（Waters，1525），固相萃取真空装置（CNW，SBEQ-CR1012），真空泵（Autoscience），固相萃取柱（Waters，Sep-Pak），电子天平（梅特勒-托利多，XP205DR），超纯水机（Millipore，Milli-Q A10），0.45μm尼龙过滤膜（Memebrane Solution），0.45μm尼龙针式过滤器（Merck Millipore）。

2.3 色谱条件 S U P E L C O S I L C8（5 c m×4.6 m m，5 μ m）色谱柱；进样量100μL；流速0.5mL/min；流动相A[0.2mmol/L己烷磺酸钠水溶液-甲醇（V/V=1:1），0.45μm过滤膜过滤，用磷酸和1mol/L氢氧化钠调节pH=（3.1±0.05）]和流动相B[1mmol/L氯化钠-7.5mmol/L三乙胺盐酸盐混合水溶液-甲醇（V/V=1:9），0.45μm过滤膜过滤，用磷酸和1mol/L氢氧化钠调节pH=（3.1±0.05）]；梯度洗脱[流动相B（0～8）min，流动相A（8～17）min]；紫外检测波长235nm；柱温25℃。

2.4 PAPB标准储备液的制备 精密称量0.0257g PAPB对照品，用0.01mol/L盐酸溶解并定容至50mL得到51.4μg/mL PAPB标准储备液。

2.5 样品检验液的制备 固相萃取柱先用4mL甲醇活化，再用4mL硼酸盐缓冲液（0.2mmol/mL硼酸-0.005mmol/mL硼酸钠-0.2mmol/mL氯化钠混合水溶液，0.45μm过滤膜过滤，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节pH值7.1～7.4）冲洗；然后用固相萃取真空装置慢速富集20mL样品，用4mL高纯水淋洗至真空抽干；最后用4mL 0.1mol/L盐酸洗脱，0.45μm针式过滤器过滤得到样品检验液。

3 结果与讨论

3.1 系统适应性 用0.1mol/L盐酸将PAPB标准储备液稀释成一定浓度的标准工作液，按照2.3色谱条件进样测定，记录色谱图，分析本研究中色谱条件对PAPB的系统适应性，结果表明理论塔板数约为4000，PAPB与相邻共存物的分离度为2.2，拖尾因子为1.03。色谱图见附图1。

3.2 样品的富集 角膜接触镜护理液中PAPB含量约为1μg/mL，在2.3色谱条件下直接进样测定，PAPB信号响应值（峰高）较低，基线噪音、杂质峰或者相邻共存物等因素的干扰会降低定量的准确性，故采用固相萃取对样品进行2.5中的富集-洗脱，得到样品检验液。

另外，本研究中考虑到对样品进行富集-洗脱后，可能引入的新物质、新杂质对PAPB色谱峰保留时间的影响，造成PAPB标准工作液无法直接用于外标法定量，而也需要进行2.5中的富集-洗脱，故按照2.3色谱条件，分别对相似浓度的PAPB标准工作液与样品检验液进样，液相色谱图显示并无明显差异，见附图2。结果表明PAPB标准工作液无需进行富集-洗脱，即可用于外标法定量的标准曲线制备。

3.3 标准曲线 用0.1mol/L盐酸逐级稀释PAPB标准储备液得到2.57μg/mL～25.7μg/mL的PAPB标准工作液。将上述标准工作液按照2.3色谱条件进样测定，得到PAPB含量对应的峰面积，以峰面积（y）为纵坐标，含量（x，μg/mL）为横坐标，线性回归。结果表明PAPB在浓度2.57μg/mL～25.7μg/mL范围内与峰面积保持良好的线性关系，线性回归方程为y=470000x-103000，相关系数为r=0.9999。

3.4 灵敏度 将PAPB标准储备液逐级稀释，按照2.3色谱条件进样测定，当信噪比（S/N）=3时，本方法检出限为0.514μg/mL。

3.5 精密度 取一定浓度的PAPB标准工作液，按照2.3色谱条件连续进样5次，得到PAPB峰面积，计算其变异系数（RSD）为1.1%（n=5），表明本方法精密度良好。

3.6 加标回收率 精密量取已知PAPB含量（1.295μg/mL）的样品20mL，共6份；分别精密加入PAPB标准储备液（51.4μg/mL）适量，按照2.5制备检验液，按照2.3色谱条件进样测定检验液中PAPB含量，并计算回收率，结果见附表1。

3.7 样品含量测定 按照2.5制备样品检验液，按照2.3色谱条件进样测定，按外标法计算样品中PAPB含量，结果见附表2。

4 结论 本研究表明，固相萃取-高效液相色谱法用于角膜接触镜护理液中聚氨丙基双胍含量的测定，具有良好的线性范围、重复性好、准确度高、易于操作和推广，能为此类产品的风险控制和行业标准的制修订提供技术依据。