粗壮脉纹孢菌降解豆皮粗纤维产可发酵糖培养基优化及单糖分析

张　玮，杨建远，2，范亚苇，*，邓泽元

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌　330047；2.九江学院药学与生命科学学院，江西 九江　332000）

粗壮脉纹孢菌降解豆皮粗纤维产可发酵糖培养基优化及单糖分析

张玮1，杨建远1，2，范亚苇1，*，邓泽元1

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌330047；2.九江学院药学与生命科学学院，江西 九江332000）

研究考察了粗壮脉纹孢菌固态发酵豆皮酒糟培养基产纤维素酶的最优培养基组成，并用气相色谱法对该发酵条件下豆皮纤维素降解所产的可发酵糖进行定性检测。结果表明：产纤维素酶的最优培养基组成为豆皮64%、酒糟34%、（NH4）2SO42%，在此培养基中粗壮脉纹孢菌发酵产纤维素酶的酶活力为2.83 IU/g，较优化前的1.17 IU/g提高了141.88%，还原糖产量为18.01 g/100 g，较优化前9.91 g/100 g提高了81.74%。获得的可发酵糖的单糖组成主要为葡萄糖和木糖。

豆皮；粗壮脉纹孢菌；纤维素酶；可发酵糖；气相色谱法

豆皮是大豆加工过程中的副产物，一般被用作动物饲料［1］，或者直接焚烧处理。不仅引起环境污染，而且造成生物质资源的浪费和经济损失。以纤维素、半纤维素为原料生产的纤维乙醇，能有效地缓解粮食短缺、能源危机问题。含有丰富的纤维素和半纤维素的豆皮，是生产纤维乙醇的优质原料，然而，如何有效降解豆皮粗纤维一直是一个难题。

目前，降解木质纤维素的方法有很多［2］，其中酶解法耗能低，处理条件温和，无污染，是一种可持续发展的有效方法。但纤维素酶高昂的价格使得生产成本上升，成为乙醇发酵工业的限制因素。寻求一种既经济又高效的预处理方法，对于纤维乙醇的生产有重要的意义。

纤维素酶是一类能水解纤维素中β-1，4糖苷键，将纤维素降解成葡萄糖的酶系的总称。一个高效完整的纤维素酶通常是由功能不同的三类葡萄糖苷酶组成，它们分别为：内切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1，4-β-D-glucannase，EC3.2.1.91）和β-葡聚糖苷酶（β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21）。3 种酶在协同作用下水解纤维素这一直链高聚物［3］。国内外已有利用产纤维素酶的微生物降解纤维原料的报道［4-6］，但对比其他的处理方法（酸、碱处理法［7］）可发酵糖得率还不理想，瓶颈在于其纤维素酶的产率低［8］，纤维素酶系组成单一。

本实验选用的粗壮脉纹孢菌，是由南昌大学食品科学与技术国家重点实验室自行筛选并诱变育种的一株高产纤维素酶的菌株［9］。它不仅具有健全的纤维素酶系，而且在高纤维含量的培养基上生长旺盛。拟利用这一特性降解豆皮粗纤维，以期得到高产量的可发酵糖，为纤维乙醇的生产开发奠定基础。考虑到豆皮的营养成分不足，所以需要补充一些营养成分并对其进行优化才能适合于粗壮脉纹孢菌生长和降解豆皮粗纤维。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种与培养基

粗壮脉纹孢菌（Neurospora crassa），南昌大学食品科学与技术国家重点实验室自行筛选并保存。

斜面培养基：PDA培养基；活化培养基：沙氏培养基。

1.1.2纤维原料

豆渣市售；豆皮、酒糟江西省茂昌实业有限公司。

1.1.3仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；HD-650超净工作台苏州苏杰净化设备有限公司；HWS-150恒温恒湿培养箱上海精宏实验设备有限公司；AR323CN电子天平奥豪斯仪器（上海）有限公司；HH-SⅡ恒温水浴锅巩义市英峡华仪器厂；15R型高速冷冻离心机江西省立康科技公司；DFT-200粉碎机温岭市大德中药器械有限公司；722紫外-可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；6890N气相色谱仪美国Agilent公司；ALPHA2-4LSC真空冷冻干燥机德国Christ公司。

1.2方法

1.2.1孢子悬浮液的制备

在超净工作台上称取1 g活化好的孢子加入装有无菌水和玻璃珠的锥形瓶中（100 mL/250 mL），在摇床上充分振荡30 min，用血球计数板计数并调整浓度为108个/mL。

1.2.2培养条件

将1 mL孢子悬浮液接种在已灭菌的固体培养基中，30 ℃恒温，70%恒湿培养3 d测定其纤维素酶活力。

1.2.3粗酶液的制备

将发酵后的培养基用玻璃研钵粉碎均匀后，称取1 g固体发酵物，加入0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠（pH 5.2）缓冲液10 mL，180 r/min振荡30 min。4 ℃离心10 min，取上清液即为粗酶提取液。

1.2.4酶活力测定

滤纸酶活力（filter paper activity，FPA）、内切-β-葡聚糖酶（简称Cx酶）活力、外切-β-葡聚糖酶（简称C1酶）活力、β-葡萄糖苷酶（简称βG酶）活力的测定方法见参考文献［10-13］。

酶活力单位定义：在50 ℃、pH 5.2条件下，1 mL粗酶提取液每分钟水解底物产生1 μmol产物的酶量定义为1 个酶活力单位，用IU/mL表示，换算成每克湿物料含有的酶活力，用IU/g表示。

1.2.5Plackett-Burman试验设计

由于纤维素酶的调节因子ace2只受纤维素的影响［14］，所以真菌必须在含纤维素的培养基上才能代谢产纤维素酶。但是，不同纤维原料的纤维组成和结构不同，所以诱导生产纤维素酶的活性差异较大［15］。根据研究前期的不断摸索，本试验在采用豆皮为主要原料的基础上，再选择豆渣和酒糟为补充碳源。选用试验次数N=12的Plackett-Burman试验设计，以酒糟、豆渣、（NH4）2SO4、KH2PO4、CaCl2、MgSO4这6 个因素为研究对象，另外选择3 个虚拟项用于估计误差，以每克湿物料含有的滤纸酶活力为响应值，从中筛选出固体培养基中影响酶活力的主要影响因素。滤纸酶活力与产物中的还原糖产量表现出相似的变化趋势，因此认为滤纸酶活力可代表纤维素酶的总活力［16］。Plackett-Burman设计各因子水平见表1。

表1　Plackett-Burman试验设计因素水平Table 1 Levels of variables chosen for Plackett-Burman design

1.2.6最陡爬坡试验设计

最陡爬坡试验将响应值的变化和梯度方向作为爬坡方向，根据各因子的变化大小来判断变化步长，快速、高效的逼近最佳值区域［17］。根据Plackett-Burman试验数据分析，酒糟和（NH4）2SO4对纤维素酶的酶活力有显著影响。

1.2.7中心组合试验设计

筛选出影响粗壮脉纹孢菌发酵产纤维素酶的主要影响因子，并确定其最大响应区域后，采用两因素五水平的中心组合试验（central composition design，CCD）对酒糟和（NH4）2SO4的添加量进一步优化，以获得该菌产纤维素酶的最佳培养基。中心组合试验设计及水平取值见表2。

表2　中心组合试验设计因素水平Table 2 Levels of variables chosen for central composition design

1.2.8还原糖含量测定

取1 g样品，加入0.1 mol/L，pH 5.2的柠檬酸缓冲溶液10 mL，150 r/min振荡提取30 min。离心，取上清液用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定还原糖的含量［18］。

式中：m1为水解液中还原糖的质量/g；m2为纤维素水解理论上生成葡萄糖的质量/g；37.77%为豆皮中粗纤维的含量。

1.2.9可发酵糖单糖组分测定

1.2.9.1粗糖提取液

称取10 g培养物，加入200 mL蒸馏水，50 ℃水浴30 min，离心，取上清液。提取3 次。

1.2.9.2样品除杂脱色

采用Sevag法脱蛋白，AB-8大孔树脂脱色［19］。

1.2.9.3标准单糖样品的乙酰化［20］

准确称取10 mg葡萄糖、木糖标准品及其混合物。分别溶于10 mL超纯水中，加入NaBH410 mg室温下还原3 h，用乙酸中和过量的NaBH4，加入少量甲醇，减压浓缩蒸干。然后加入10 mL醋酐，100 ℃条件下反应1 h，加入少量甲苯，减压浓缩蒸干。将乙酰化的产物用氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量超纯水充分振荡，除去上层水溶液，重复2～4 次，氯仿层用适量的无水硫酸钠干燥，定容至10 mL，待气相色谱（gas chromatography，GC）分析。

1.2.9.4菌液单糖的乙酰化

将经过除蛋白、脱色后的单糖提取液冷冻干燥，准确称取10 mg样品，加入10 mL超纯水溶解。之后同1.2.9.3节中所述方法进行乙酰化操作。

1.2.9.5气相色谱条件

色谱柱使用Agilent HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）［21］；检测器：FID；载气：N2；柱流速：0.6 mL/min，分流比：30∶1。进样口温度：280 ℃，检测器温度250 ℃。H2流速：40 mL/min，空气流速：400 mL/min，尾吹N2流速：30 mL/min。进样量：1 μL。

程序升温：160 ℃保持2 min然后以10 ℃/min上升至240 ℃，保持20 min。

1.3数据统计分析

实验数据采用Design-Expert 8.05软件进行统计分析，P＜0.05为显著性水平。

2　结果与分析

2.1Plackett-Burman试验筛选产酶培养基主要影响因素Plackett-Burman设计及试验结果如表3所示。

表3　Plackett-Burman试验设计方案及结果Table 3 Plackett-Burman experiment design with response values

应用Design-Expert 8.05对表3中的Y值进行回归分析，所得Plackett-Burman回归分析结果见表4。

表4　Plackett-Burman试验结果方差分析Table 4　Regression analysis of the experimental results from Plackett-Burman design　ign

由表4可知，所有因素对FPA的影响均为正效应，其中，酒糟添加量（P=0.009 4）、（NH4）2SO4添加量（P=0.002 2）在99%概率水平上差异显著，由F值可以看出，酒糟和（NH4）2SO4添加量的F值分别为16.77、33.31。因此，选择酒糟和（NH4）2SO4添加量进一步考察它们对FPA的影响。

2.2主要影响因素最陡爬坡试验

表5　最陡爬坡试验结果Table 5 Results of steepest ascent tests

由Plackett-Burman试验结果可知，酒糟和（NH4）2SO4的添加量对FPA呈正效应，即增加二者的添加量，FPA呈增长趋势。所以应适当增加酒糟和（NH4）2SO4的添加量，提高发酵物中的FPA。由表5可知，随着酒糟和（NH4）2SO4添加量的增加，FPA呈先增后减的趋势，其中试验组3中FPA最高，故以试验组3的条件为响应面试验的中心点。

2.3响应面法优化培养基配方

以最陡爬坡试验得到的最佳试验点为中心点，以FPA为响应值设计中心组合试验。试验结果如表6所示。

表6　中心组合试验设计及结果Table 6　Central composite design with experimental results

根据试验结果，运用软件进行拟合和二次模型方差分析，得到响应曲面二次多元回归模型：

FPA=-4.113 07+30.767 34A+80.649 49B+ 800AB-60.75A2-8 975B2

对该模型进行方差分析，由表7方差分析可知，模型P=Prob＞F=0.000 1，表明该模型极显著，失拟项P= Prob＞F=0.089 2不显著，该模型的决定系数R2=0.984 7，说明该模型与实际情况的拟合程度好，可用于粗壮脉纹孢菌发酵产纤维素酶的最佳培养基组分的分析和预测。

由表7的方差分析结果可知，酒糟和（NH4）2SO4的添加量对粗壮脉纹孢菌产纤维素酶的线性影响和曲面影响极其显著，而二者的交互影响不显著。这一结论也可从响应面图及等高线图中直观地反映出来。

表7　回归模型的方差分析Table 7 Analysis of variance of each term in regression equation

图1 酒糟和（NHNH4）2SOSO4添加量对滤纸酶酶活力交互作用的响应面（a）a和等高线图（b）bFig.1　Response surface （a） and contour plots （b） for the effect of distillers’ grains and ammonia sulfate on cellulase activity

通过软件计算，确定产纤维素酶培养基的最佳组成为：豆皮64%、酒糟34%、（NH4）2SO42%。在此最优条件下，纤维素酶活力为2.83 IU/g。

2.4验证实验

为验证上述试验结果，设计3 组平行实验，按照最优培养基：豆皮64%、酒糟34%、（NH4）2SO42%作为产纤维素酶固态发酵培养基，在1.2.2节的条件下发酵，优化后的纤维素产量达到2.83 IU/g，与理论值接近，因此，通过响应面法优化的培养基组分参数准确可靠，具有一定的实践参考价值。

2.5优化前后的对比实验

将优化前的纯豆皮发酵和优化后的混合豆皮发酵产的纤维素酶活力及还原糖产量进行了比较。结果如表8所示。

表8　优化前后纤维素酶活力和还原糖产量的比较Table 8　Comparison of cellulase activity and reducing sugar production before and after medium optimization

由表8可知，优化后的培养基产纤维素酶的各组分酶活力都明显优于优化前，且还原糖的产量也得到了显著提高，这对于后续的乙醇发酵有重大的意义。

2.6可发酵糖单糖组分的研究

图2　单糖混合标准品气相色谱图Fig.2　GC chromatogram of mixed monosaccharide standards

图3　可发酵糖的单糖组成气相色谱图Fig.3　GC chromatogram of monosaccharides in fermantable sugars

图2为葡萄糖和木糖混合标准品的气相色谱图，根据单标的气相色谱中标准品的保留时间可知，1号峰为木糖，保留时间为6.455 min，2号峰为葡萄糖，保留时间为12.663 min，两种单糖之间的分离效果好。图3为豆皮降解产物中可发酵糖的单糖组成气相色谱图，根据标准品的保留时间可知，1号峰为木糖，3号峰为葡萄糖。2号峰和4号峰物质由于含量极低，缺乏研究意义，故在此不做讨论。面积归一法［22］可以通过总峰面积和单个峰面积计算出各单糖的百分含量，计算结果如表9所示。

表9　标准单糖与可发酵单糖组分气相色谱分析结果Table 9 GC retention times and contents of monosaccharides

由表9可知，豆皮的降解产物中可发酵单糖主要由葡萄糖和木糖组成，其含量分别为56.03%和30.52%，葡萄糖的含量略高于木糖，这与稀酸水解的结果恰好相反［23］。在稀酸水解过程中，由于半纤维素结构松散，所以更易被水解成木糖、阿拉伯糖等。而要达到水解纤维素的目的，只有升高温度至120 ℃左右，才能水解少部分纤维素，葡萄糖得率低［24］。与稀酸水解不同，纤维素酶能定向水解纤维素产生葡萄糖［25］，所以水解产物中绝大部分的单糖均为葡萄糖，更有利于之后的乙醇发酵。而产物中的木糖可转化为木糖醇［26］。

3　结 论

通过Plackett-Burman试验确定豆皮、酒糟和（NH4）2SO4的添加量是纤维素酶活力的主要影响因子。通过最陡爬坡试验和响应面优化试验确定最佳培养基配方为：豆皮64%、酒糟34%、（NH4）2SO42%。在此条件下，纤维素酶活力提高了141.88%，由最初的1.17 IU/g提高到2.83 IU/g。还原糖产量提高了81.74%，由最初的9.91 g/100 g提高到18.01 g/100 g。

在不少研究报道中，产酶培养基中一般需要添加一些参与菌体生长和物质代谢所必需的矿质元素和无机盐，如磷酸盐、Ca、Mg等。但本实验研究发现，固态发酵培养基仅由豆皮、酒糟和（NH4）2SO4组成，就能完全满足粗壮脉纹孢菌发酵产纤维素酶的营养需求。豆皮中含有丰富的矿物质，如Ca（0.4%～0.66%）和P（0.11%～0.25%），但大多以植酸盐及其络合物的形式存在，矿质元素以这种形式存在很难被微生物利用［27］。周小玲［28］发现，粗壮脉纹孢菌具有分泌植酸酶的功能，而植酸酶能催化植酸分解生成无机磷酸和肌酐，消除植酸与金属离子或蛋白质之间螯合或络合作用，增加培养基中的可利用矿质元素，提高有机磷和矿物质的生物利用率。因此，在不添加矿物质和无机盐的固态培养基中，粗壮脉纹孢菌也能分泌产高活性的纤维素酶。

通过气相色谱法分析了降解产物中可发酵单糖的组成，结果可发酵糖主要由葡萄糖和木糖组成，且葡萄糖产量更高，更有利于后续的乙醇发酵。而木糖同样可以被转化为木糖醇，作为乙醇发酵的副产品，增加生物质能的经济价值。

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Optimization of Medium Composition for Soybean Hull Fiber Degradation by Neurospora crassa and Monosaccharide Composition Analysis of the Resulting Fermentable Sugars

ZHANG Wei1， YANG Jianyuan1，2， FAN Yawei1，*， DENG Zeyuan1
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang330047， China；2. College of Pharmaceutical and Life Sciences， Jiujiang University， Jiujiang332000， China）

In this work， Plackett-Burman design and response surface methodology were applied to optimize the solid medium containing soybean hull and distillers' grains to produce cellulase by Neurospora crassa. Meanwhile， the monosaccharide composition of fermentable sugars from the degraded product under optimal culture medium was analyzed by gas chromatography. The results showed that the optimal medium was composed of 64% soybean hull， 34% distillers' grains and 2% ammonia sulfate. Under the optimal condition， the activity of cellulase significantly was improved by 141.88%， from 1.17 IU/g to 2.83 IU/g， and the yield of reducing sugar was increasedby 81.74%， from 9.91 g/100 g to 18.01 g/100 g compared to that obtained with the unoptimized medium. The major monosaccharide components of the resulting fermentable sugars were glucose and xylose， respectively.

soybean hull； Neurospora crassa； cellulase； fermentable sugar； gas chromatography （GC）

S216

A

1002-6630（2015）23-0209-06

10.7506/spkx1002-6630-201523039

2015-01-26

江西省科技支撑计划项目（20133BBF6002）

张玮（1989—），女，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生学。E-mail：permanent_wei@163.com

范亚苇（1969—），女，副教授，博士，研究方向为微生物代谢。E-mail：fanyw6601@sina.com