黄秋葵汁乳酸菌混菌发酵条件优化

崔　莉，李大婧，刘春泉，*，刘莹萍

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京　210014；2.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州　225127）

黄秋葵汁乳酸菌混菌发酵条件优化

崔莉1，李大婧1，刘春泉1，*，刘莹萍2

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京210014；2.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州225127）

为制备风味优良的乳酸发酵黄秋葵汁，研究了肠膜明串珠菌和植物乳杆菌以不同组合在发酵黄秋葵汁中的生长、产酸、感官品质以及挥发性风味成分。结果表明：植物乳杆菌单菌发酵黄秋葵汁可以在24 h内将pH值降到4.5以下，活菌数可达107CFU/mL。肠膜明串珠菌单菌发酵黄秋葵汁无法顺利产酸。肠膜明串珠菌和植物乳杆菌以其菌液体积比2∶1混合发酵黄秋葵汁，可迅速将pH值降到4.5以下，活菌数可达108CFU/mL，且感官品质优于植物乳杆菌单菌发酵。气相色谱-质谱联用方法分析可知，混菌发酵生成的挥发性成分比植物乳杆菌单菌发酵种类更多、含量更高。黄秋葵汁乳酸发酵最佳工艺条件为：肠膜明串珠菌和植物乳杆菌菌液以2∶1比例混合、接种量5%、发酵温度35 ℃、发酵时间72 h。

黄秋葵；乳酸发酵；混菌发酵；挥发性风味成分

黄秋葵（Abelmo schus esculentus （Linnaeus） Moench）别名秋葵、黄葵、羊角菜、越南芝麻、洋辣椒、补肾草、美人指等，英文名Okra，为锦葵科秋葵属一年生草本植物，在热带地区可越年生长。 黄秋葵在世界各地均有栽培，以美国、印度、埃及种植居多。中国种植较多的主要有福建、江西、北京、广东等地。

黄秋葵嫩荚果营养丰富，蛋白质、维生素及矿物质含量都高于一般蔬菜和水果［1］，黄秋葵果实粉［2］、水提液［3-4］、多糖［5］、黄酮［6］、花多糖［7］和种子中的生物碱［8］可提高小鼠在应激状态下的生存能力，对运动性疲劳恢复、抗疲劳能力和免疫力提高具有促进作用。黄秋葵果实粉具有降血脂作用［9］。黄秋葵粗多糖［10-11］和黄秋葵花提取物［12］具有显著体外抗氧化活性。美国人称之为“植物伟哥”，日本人称其为“绿色人参”，还被许多国家定为运动员的首选蔬菜。可见黄秋葵作为一种具有较高营养价值的新型保健蔬菜，其生产和加工前景广阔，具有极大的开发潜力。

已有黄秋葵的加工工艺研究报道主要有干燥工艺［13-15］、保鲜贮藏工艺［16］、净菜加工工艺［17］、黄秋葵酸奶制备工艺［18］、黄秋葵软罐头制备工艺［19］以及黄秋葵多糖［20］、籽油和籽蛋白酶解肽［21-22］果胶及不溶性纤维提取［23-24］等。虽然上述加工工艺研究报道较多，但真正在生产实际中应用的较少，市场上黄秋葵主要以鲜食为主，存在加工产品少，水平低、综合利用程度差等缺陷，极大地制约了其产业发展，亟待大力开展黄秋葵加工技术研究。

本实验通过比较肠膜明串珠菌和植物乳杆菌以不同组合在黄秋葵汁中的生长特性、生成的挥发性风味成分以及感官品质，研究适合黄秋葵汁乳酸发酵的适宜菌种及发酵条件。为开发兼具黄秋葵和乳酸发酵的营养保健价值的黄秋葵果荚乳酸发酵汁产品提供了基础，该产品消除了乳酸发酵乳制品乳糖不耐和高胆固醇，乳品过敏原等缺陷，含有丰富的维生素、微量元素、膳食纤维，且具有抗氧化功能，符合现代消费需求，市场前景广阔。

1　材料与方法

1.1材料与菌株

黄秋葵：五福或南洋，当年8月采收自江苏省农业科学院实验田。

肠膜明串珠菌SICC1.498和植物乳杆菌SICC1.376均购自四川省微生物资源平台菌种保藏中心，编号分别为SICC1.498和SICC1.376，所用试剂均为分析纯试剂。

1.2仪器与设备

HYG-A全温摇瓶柜中国太仓实验设备厂；LRH-150生化培养箱中国上海一恒实验设备有限公司；SW-CJ-IFD洁净工作台中国苏净集团安泰公司；电热手提式压力蒸汽消毒器中国上海医用核子仪器厂；布鲁克SCION SQ单四极杆气相色谱-质谱联用仪美国布鲁克公司。

1.3方法

1.3.1生产工艺流程

黄秋葵果荚→清洗→烫漂→打浆→酶解→制汁→调配→杀菌→发酵→杀菌→冷却→检验→成品

1.3.2黄秋葵乳酸发酵汁制备

原料加工：称取品种为五福或南洋的新鲜黄秋葵，挑选去杂。

烫漂：取自来水，煮沸，加入黄秋葵，保持沸水烫漂1.5 min后，迅速取出，经冷自来水中冷却后，沥水后，速冻，冻藏。

打浆：取烫漂后黄秋葵，以1∶4（m/V）加水，打浆。

酶解：黄秋葵汁中加入0.25 g/L纤维素酶和0.3 g/L果胶酶，55 ℃搅拌2 h，然后加热到沸腾维持1 h，以4 000 r/min，离心10 min，过滤。

调配：在黄秋葵汁中加入8 g/100 mL蔗糖和0.2 g/100 mL柠檬酸，加热溶解。

杀菌：高压灭菌锅121 ℃，杀菌15 min。

发酵种子液制备：在无菌操作台上，用接种环挑取4 ℃斜面保存的发酵菌种肠膜明串珠菌和植物乳杆菌，分别接种于MRS液体培养基试管中，35 ℃条件下静置培养36 h，制备一级种子液（含菌量为107～109CFU/mL）。将一级种子液分别转接于100 mL三角瓶MRS液体培养基中，35 ℃条件下静置培养36 h，制备二级种子液。将二级种子液分别转接于杀菌的黄秋葵汁中，35 ℃条件下静置培养72 h，制备生产种子液。然后，将两种生产种子液（肠膜明串珠菌、植物乳杆菌）分别以体积比1∶1、1∶2和2∶1混合，接种量5%，接种于杀菌黄秋葵汁中。

黄秋葵汁发酵工艺：将已接种的黄秋葵汁，在35 ℃条件下发酵72 h。

杀菌：100 ℃热脱气杀菌15 min。

1.3.3感官评价

选取色泽、滋味香气和口感作为评定对象，以黄秋葵乳酸菌发酵汁感官质量评定标准（表1）进行感官评价。参加评定的人员由12 名食品专业的科技人员组成。按照标准分别对黄秋葵乳酸菌发酵汁的各项指标进行等级评定，避免交谈，并记录评分结果。

表1　黄秋葵乳酸菌发酵汁感官质量评定标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented okra juice

1.3.4理化及微生物指标测定

挥发性风味成分的测定［25］：取5 mL左右样品置于15 mL顶空瓶中，将老化后的75 μm Car/PDMS萃取头插入样品瓶顶空部分，50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。接口温度250 ℃，离子源温度200 ℃，灯丝电流0.08 mA，电子能量70 eV，检测器电压1 000 V。气相色谱条件：DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 .m），程序升温：40 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至90 ℃，然后再以10 ℃/min升至230 ℃，以230 ℃保持7 min。

定性定量分析：扫描结果与MAINLIB、NISTDEMO、REPLIB和WILLEY 4 个谱库对照进行成分鉴定，采用峰面积归一化定量计算出各组分的相对含量。

总酸度测定：采用酸碱滴定法。

乳酸菌菌落总数测定：参照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》，用MRS培养基代替其中的平板计数琼脂培养基。

2　结果与分析

2.1肠膜明串珠菌单菌发酵黄秋葵汁的理化和微生物指标

表2　由肠膜明串珠菌发酵黄秋葵汁的理化和微生物指标Table 2 Physicochemical and microbial indices of fermented okra juice by Leuconostc mesenteroides

由表2可知，在黄秋葵果荚汁中只接种肠膜明串珠菌，经过72 h发酵后，仍无法将体系的pH值降到4.5以下，酸度仅为0.24%，表明肠膜明串珠菌单菌不适合发酵黄秋葵汁。

2.2植物乳杆菌单菌发酵黄秋葵汁的理化和微生物指标

表3　由植物乳杆菌发酵黄秋葵汁的理化和微生物指标Table 3　Physicochemical and microbial indices of fermented okra juice byby Lactobacillus plantarum rum

由表3可知，植物乳杆菌在24 h之内就能将体系的pH值降到4.5以下，表明此单一菌种可以在黄秋葵汁中顺利产酸，生长状况良好。

2.3混菌发酵黄秋葵汁的理化和微生物指标

表4　由肠膜明串珠菌和植物乳杆菌（22∶1，1　V/V）混合发酵黄秋葵汁的理化和微生物指标Table 4　Physicochemical and microbial indices of fermented okra juice by 2：1 （21 V/V） mixture of e of Leuconostc mesenteroides des and　and Lactobacillus plantarum arum

经感官评定，发现肠膜明串珠菌和植物乳杆菌以体积比1∶1和1∶2混合后感官评价值低（数据未列出），所以选择肠膜明串珠菌和植物乳杆菌以体积比2∶1混合进行后续实验。由表4可知，以植物乳杆菌和肠膜明串珠菌混菌发酵黄秋葵汁，在24 h之内就能将体系的pH值降到4.5以下，表明二者混合后可以在黄秋葵汁中顺利产酸，生长状况良好。

2.4不同菌种发酵黄秋葵汁感官评价

经感官评定上述两种菌种单独发酵制备的黄秋葵果荚汁，发现肠膜明串珠菌单菌发酵组有清淡的发酵泡菜香味，微酸，消费者可以接受，感官得分为76.15±3.42，达到“良”标准。植物乳杆菌单菌发酵组酸味刺激，具有强烈的酸菜味，消费者无法接受，感官得分为65.11±4.43，达到“差”标准。二者混合后制备的发酵黄秋葵汁经感官评价，得分为82.14±1.91，达到“好”的标准。

2.5不同菌种发酵黄秋葵汁的挥发性香气成分

表5　不同菌种发酵黄秋葵汁生成相同香气物质分析TTaabbllee　55 　VVoollaattiillee　ccoommppoonneennttss　iinn　ffeerrmmeenntteedd　ookkrraa　jjuuiiccee　bbyy　ddiiffffeerreenntt　llaaccttiicc acid bacteerriiaa

为了验证感官评价的结果，检测了不同菌种发酵黄秋葵汁的香气物质成分，将不同菌种生成相同风味成分的种类和含量结果见表5，混菌发酵黄秋葵汁生成的挥发性香气成分种类和含量均优于单一菌种发酵的黄秋葵汁，结合2.4节的感官评定结果可知混菌发酵黄秋葵汁的风味比单菌发酵更饱满丰富。

3　讨 论

在自然界中，微生物是多菌种共生的。在共生过程中，菌种间通过信号分子互相影响其生长特性。在上述的共生作用中，多数对人类有益，少数对人类不利。近年来，有关乳酸菌和酵母菌的共生作用研究较多，二者的共生能够促进细菌素的生成［26］和生物膜的形成［27］。闫彬［28］发现，乳酸菌和酵母菌在双菌培养基中有利于产出更多的风味物质，例如乙醛、乳酸、丁二酮、甲酸、乙酸、丙酸等。乳酸菌之间的共生作用则鲜见报道，胡春霞等［29］用卷心菜进行发酵实验发现，与自然发酵相比，单菌和混菌发酵所制泡菜在色泽和风味等方面均有所提高，发酵时间也大大缩短。周彬等［30］研究了大白菜乳酸菌乳链球菌和植物乳杆菌混合发酵中的生长、产酸以及环境因子的影响，并对混菌发酵的风味物质作了分析。结果表明，混菌发酵产物风味物质的组成与自然发酵相似，不同于单菌发酵；混菌发酵风味物质的组成并不是两菌单独发酵的简单加和，混合发酵会明显改善发酵产物的风味。本实验也从两种乳酸菌混合发酵后的发酵性能、风味成分的种类和含量以及感官评价三方面指标佐证了上述研究结论。下一步的研究将集中于混菌发酵后风味成分的代谢途径和信号传递的变化规律，进一步阐明混菌发酵优于单菌发酵的机理。

4　结 论

肠膜明串珠菌单一菌种在黄秋葵汁中生长状况不佳，植物乳杆菌单一菌种在黄秋葵汁中生长状况良好，二者以体积比2∶1混合后在黄秋葵汁中生长状况良好。二者混合后发酵黄秋葵汁生成的挥发性香气成分较单一菌种发酵种类更多、含量更高，由感官评定结果可知混菌发酵黄秋葵汁的风味显著优于单菌发酵。黄秋葵汁乳酸发酵最佳工艺条件为：肠膜明串珠菌和植物乳杆菌菌液以2∶1比例混合、接种量5%、发酵温度35 ℃、发酵时间72 h。

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Optimization of Fermentation Conditions for Okra Juice by Two Mixed Species of Lactic Acid Bacteria

CUI Li1， LI Dajing1， LIU Chunquan1，*， LIU Yingping2
（1. Institute of Farm Product Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing210014， China；2. College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou225127， China）

To select lactic acid bacteria stains for okra fermentation， single and mixed inoculums of two species of lactic acid bacteria （Leuconostc mesenteroides and Lactobacillus plantarum） were investigated by measuring pH， total acid，viable cell counts， volatile components and sensory evaluation of fermented okra juice. Lactobacillus plantarum when inoculated singly grew rapidly in okra juice and reached nearly 107CFU/mL and pH 4.5 after 24 h fe rmentation， whereas Leuconostc mesenteroides alone was not useful for acid production during fermentation of okra juice. Fermentation with a mixture of Leuconostc mesenteroides and Lactobacillus plantarum （2：1， V/V） fast reduced the p H to less than 4.5 （high acid） and resulted in a large number of living lactic acid bacteria （108CFU/mL）. GC-MS results showed that fermented okra juice was more conducive to producing flavor compounds through mixed-culture fermentation compared with pure-culture fermentation. Sensory evaluation results also showed that mixed-culture fermentation of okra juice was more desirable than single-strain fermentation. The best inoculum for okra juice was the 2：1 mixture （V/V） Leuconostc mesenteroides and Lactobacillus plantarum. The optimal fermentation parameters were determined as 5%， 35 ℃ and 72 h for inoculum amount，incubation temperature and fermentation duration， respectively .

okra； lactic acid fermentation； mixed bacteria fermentation； volatile components

TS201.3

A

1002-6630（2015）23-0205-04

10.7506/spkx1002-6630-201523038

2015-03-20

江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（11）2067）

崔莉（1978—），女，助理研究员，博士，主要从事食品微生物与果蔬发酵技术研究。E-mail：sunnycuili@gmail.com

刘春泉（1959—），男，研究员，硕士，主要从事农产品精深加工研究。E-mail：liuchunquan2009@163.com