超声波辅助提取金钗石斛多糖工艺优化研究

邓维泽，唐显福，古霞，闫天龙，杨文宇，李明元*，

（1.西华大学生物工程学院/四川省食品生物技术重点实验室，四川成都610039；2.贵州赤水仙草生物科技有限公司，贵州赤水564700）

超声波辅助提取金钗石斛多糖工艺优化研究

邓维泽1，唐显福2，古霞1，闫天龙1，杨文宇1，李明元*1，2

（1.西华大学生物工程学院/四川省食品生物技术重点实验室，四川成都610039；2.贵州赤水仙草生物科技有限公司，贵州赤水564700）

优化超声波辅助提取金钗石斛多糖工艺。以多糖提取得率为考察指标，用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，采用单因素试验正交试验法考察了料液比、超声波提取功率、提取温度和提取时间对金钗石斛多糖提取得率的影响。超声波辅助提取金钗石斛多糖的最佳提取工艺条件为：料液质量体积比1 g∶15 mL，超声波提取功率为450 W，超声波提取温度为60℃，超声波提取时间为50 min，在此条件下多糖得率为3.11%。

金钗石斛多糖；提取；工艺优化；正交试验

金钗石斛，俗称扁金钗，为兰科石斛属多年生附生草本植物［1］，是我国传统名贵中药，因其生长在特殊的环境和具有强大的滋补功效而成为“中国九大仙草”之一。金钗石斛可“益胃生津、补肾益力、延年益寿”，具有抗衰老，增强免疫力等功效［2-4］，其主要的功效成分是石斛碱及多糖类物质。金钗石斛是国家批准可用于保健食品的物品名单之一。目前，对于金钗石斛研究大多集中在石斛碱上，对于金钗石斛多糖的研究鲜见报道。作者利用超声波法辅助提取金钗石斛多糖，并通过正交试验优化提取工艺，为进一步金钗石斛多糖的分离纯化及其活性的研究提供一定的基础，为金钗石斛多糖的开发及其相关产品的研发提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

金钗石斛：贵州赤水仙草生物科技有限公司提供。烘干、粉碎，过40目筛，备用；透析袋：成都奥克生物技术有限公司产品。

1.2仪器与试剂

1.2.1主要仪器UV2800紫外可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；KQ-700DE型超声波数控清洗仪：上海沪沁仪器设备有限公司产品；RE-52A型旋转蒸发器：上海亚荣生化公司产品；Alphal-2LD plus冷冻干燥机：德国CHRIST公司产品。

1.2.2主要试剂无水葡萄糖、苯酚、硫酸、石油醚、无水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿，均为分析纯。

1.3方法

1.3.1试验样品的前处理称取金钗石斛干燥粉末，置于索氏提取器中，加入6倍体积石油醚80℃回流提取1 h，滤渣挥干溶剂，加入10倍体积分数80%乙醇，70℃回流提取2次，每次1 h，趁热抽滤，滤渣挥干溶剂，60℃干燥至恒重备用。

1.3.2金钗石斛粗制多糖的制备称取1.3.1中的样品50 g，加入500 mL蒸馏水，超声波提取（超声温度60℃，超声时间60 min，超声功率300 W），趁热过滤，减压浓缩，加入无水乙醇使溶液含乙醇体积分数至80%，静止过夜，离心得沉淀冷冻干燥即为金钗石斛粗制多糖。

1.3.3金钗石斛精制多糖的制备将1.3.2中的金钗石斛粗制多糖加蒸馏水溶解，溶液用活性炭除色素，Sevage法除去蛋白质，反复操作直至紫外-可见光扫描无明显蛋白质吸收峰为止。用透析袋48 h流水透析，蒸馏水透析24 h，除去无机盐、小分子杂质及未除尽的色素，将透析袋内多糖液醇沉，离心得沉淀，无水乙醇、丙酮各洗2遍，真空冷冻干燥至恒重即金钗石斛精制多糖［5-6］。

1.3.4金钗石斛多糖含量的测定方法金钗石斛多糖测定采用改进的苯酚-硫酸法［7］，在490 nm处测定吸光值，计算多糖含量。精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1.000 g，用蒸馏水定容至100 mL，摇匀，配置成10 mg/mL的葡萄糖标准储备液。精取葡萄糖标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于9支比色管中，分别以水补至2.0 mL，另取1支比色管加入2.0 mL蒸馏水，作为空白对照，然后各自加入质量分数5%苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸，混匀后，置于40℃水浴中加热30 min，冷水冷却至室温，在波长490 nm处测定吸光值。以葡萄糖的质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线，回归方程Y=0.089 72X-0.004 6（R2=0.999 1）。

1.3.5换算因子的测定精确称取干燥至恒重的金钗石斛精制多糖2.5 mg于50 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。从中精确吸取2.0 mL，按“1.3.4”的方法测定吸光值，根据标准曲线回归方程计算多糖质量浓度，按下式计算换算因子f=（Cs/C）。Cs为实际金钗石斛多糖的质量浓度，C为根据标准曲线计算出的质量浓度。由计算的结果可得换算因子f=1.32（n=3），纯度=1/f=1/1.32=75.76%。

1.3.6金钗石斛多糖得率测定取金钗石斛提取工艺中制备的多糖稀释液2 mL，按“1.3.4”操作，测定吸光值，根据标准曲线计算多糖稀释液的质量浓度。金钗石斛多糖得率=（f·C·N·V/m）；式中f为换算因子，C为根据标准曲线计算出的多糖稀释液质量浓度值，N为稀释倍数，V为提取工艺中的滤液体积，m为试验样品的质量。

1.3.7金钗石斛多糖提取单因素试验准确称取前处理干燥的金钗石斛粉3.0 g，放入200 mL的锥形瓶中，以水作为提取溶剂，在其他条件相同的情况下，采用不同的料液比、超声波功率、提取时间、提取温度进行超声波辅助提取试验，然后趁热过滤，精确测定滤液体积（V）。用移液管精确移取1 mL滤液于50 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度（稀释倍数N），用“1.3.4”的方法测定金钗石斛多糖的质量浓度，计算金钗石斛多糖得率，逐个考察各提取条件对提取效果的影响，确定每一因素的最佳水平。

1.3.8金钗石斛多糖提取正交试验根据1.3.7单因素试验结果，选取料液比、超声波功率、时间、温度4个因素及3个最佳水平进行正交试验L9（34），超声波辅助提取后按“1.3.4”的方法测定金钗石斛多糖的质量浓度，并计算多糖得率，确定金钗石斛多糖提取的最佳条件。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1料液比对多糖得率的影响在超声波功率400 W、超声波提取温度50℃、超声波提取时间50 min的条件下，依1.3.7的试验方法，研究料液质量体积比对多糖得率的影响，结果如图1所示。当料液质量体积比大于1 g∶20 mL时，金钗石斛多糖提取得率随料液比的减小而提高，当料液质量体积比小于1 g∶20 mL时，金钗石斛多糖提取率随料液比继续减小，反而出现多糖提取率稍微下降的情况，从实验条件和后期处理成本出发，选择1 g∶20 mL为最佳料液质量体积比。

图1　料液质量体积比对多糖得率的影响Fig.1Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysccharides

2.1.2超声波提取功率对多糖得率的影响在料液质量体积比1 g∶20 mL、超声波提取温度50℃、超声波提取时间50 min的条件下，依1.3.7的试验方法，研究超声波提取功率为300、350、400、450、500、550 W时对多糖得率的影响，结果如图2所示。由图2可知，金钗石斛多糖提取得率随着超声波提取功率增大，先增大而后减小的趋势，在超声波功率低于450 W时，多糖得率随超声波功率的增大而提高，在超声波功率高于450 W时多糖得率又随超声波功率的增大而降低，可能是由于大的超声波提取功率所产生机械效应作用使多糖的糖苷键被打断，多糖结构被破坏，使多糖得率降低［8-9］。因此选择450 W为最佳超声波提取功率。

图2　超声波提取功率对多糖得率的影响Fig.2Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysccharides

2.1.3超声波提取温度对多糖得率的影响在料液质量体积比1 g∶20 mL、超声波提取功率450 W、超声波提取时间50 min的条件，依1.3.7的试验方法，研究超声波提取温度为40、50、60、70、80℃时对多糖得率的影响，结果如图3所示。由图3可知，金钗石斛多糖提取率随着超声波提取温度的升高而增大，在40～60℃时，多糖得率随温度的升高而呈显著性增加，在60℃以后，多糖得率随温度的升高而极度缓慢的增加，从节约能源角度考虑，因此选择60℃为最佳超声波提取温度。

图3　超声波提取温度对多糖得率的影响Fig.3Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of polysccharides

2.1.4超声波提取时间对多糖得率的影响在料液质量体积比1 g∶20 mL、超声波提取功率450 W、超声波提取温度60℃的条件，依1.3.7的试验方法，研究超声波提取时间为10、30、50、70、90 min时对多糖得率的影响，结果如图4所示。在超声波提取时间10～50 min的范围内，随着提取时间的延长，金钗石斛多糖提取得率也随之提高，但是超过50 min后，继续延长超声波提取时间，金钗石斛多糖得率不再提高反而降低。这可能是超声波处理时间短，多糖溶出不完全；处理时间过长，可能对会破坏多糖结构，影响金钗石斛多糖得率。因此选择40～60 min之间为最佳的超声波提取时间。

图4　超声波提取时间对多糖得率的影响Fig.4Effect of ultrasonic treatment temperature on extraction rate of polysccharide

2.2正交试验结果

金钗石斛多糖提取效果受多个因素的交叉影响。上述试验只是单因素影响，为了确定在提取过程中这4个因素对金钗石斛多糖提取效果的影响大小，选出最佳的提取条件。依“1.3.8”的试验方法，正交试验设计见表4，正交试验结果见表5所示。

由表5可知，从极差R的大小可以看出影响金钗石斛多糖提取的4个因素的主次关系是：超声波提取功率＞超声波提取时间＞料液质量体积比＞超声波提取温度。因素C的极差很小，所以将此列作为方差分析的误差列［10］，结果见表6。F检验表明，B因素（超声波提取功率）P＜0.01，D因素（超声波提取时间）P＜0.05，说明在B因素所设的不同水平下对金钗石斛提取效果有极显著性差异，在D因素所设不同水平下有显著性差异，其他因素各水平间差异均不显著。

从正交试验结果可以看出金钗石斛多糖得率最高的提取组合是A1B2C2D2，即料液质量体积比为1 g∶15 mL，超声波提取功率为450 W，超声波提取温度为60℃，超声波提取时间为50 min。单因素试验中的4个单因素的最佳组合为A2B2C2D2，即料液质量体积比为1 g∶20 mL，超声波提取功率为450 W，超声波提取温度为60℃，超声波提取时间为50 min。下面对两者进行比较：提取功率、提取温度、提取时间相同，料液质量体积比的差异性不显著，可以忽略不计。考虑小的料液质量体积比会给后续提取液的浓缩带来困难以及节约能源，所以选择1 g∶ 15 mL的料液质量体积比更科学，更合理。综上所述，本试验条件下确定最最佳的提取条件为料液质量体积比为1 g∶15 mL，超声波提取功率为450 W，超声波提取温度为60℃，超声波提取时间为50 min。

表4　正交试验4因素3水平L9（34）表Table 4Four factors and three levels of L9（34）of the orthogonal test

表5　正交试验结果的直观分析表Table 5Results of the orthogonal test

表6　方差分析表Table 6Analysis of Variance table

3　结语

1）通过单因素及正交试验得出了超声波辅助提取金钗石斛多糖的最佳提取工艺条件为：料液质量体积比1 g∶15 mL，超声波提取功率为450 W，超声波提取温度为60℃，超声波提取时间为50 min。在此条件下金钗石斛多糖的提取得率达3.11%，各个因素对金钗石斛多糖得率的影响作用大小顺序依次为超声波提取功率＞超声波提取时间＞料液比＞超声波提取温度，这为金钗石斛多糖的深入研究提供一定的理论依据。

2）金钗石斛多糖超声波辅助提取法与热水回流提取法、水煎煮提取法比较见表7。

3）超声波辅助提取是否影响金钗石斛活性多糖的结构、破坏金钗石斛多糖的生物活性，还值得以后做进一步的研究和论证。

表7　不同金钗石斛多糖提取法比较Table 7Comparison of different extraction methods for Dendrobium nobile Lindl.polysaccharides

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl.

DENG Weize1，TANG Xianfu2，GU Xia1，YAN Tianlong1，YANG Wenyu1，LI Mingyuan*1，2
（1.College of Bioengineering/Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan Province，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.Guizhou Chishui Xian Cao Biological Technology Co.，Ltd，Chishui 564700，China）

The study aimed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl.Using extraction rate as evaluation index，the polysaccharide content was assayed by the phenol-sulfuric method.Based on the orthogonal test，the optimal ultrasonic-assisted extraction conditions were：material-liquid ratio 1∶15（g/mL），extraction power 450 W，temperature 60℃and time 50 min.With the optimal conditions，the extraction rate of polysaccharides was up to 3.11%.

Dendrobium nobile Lindl.polysaccharides，extraction，process optimization，orthogonal test

R 931.71

A

1673—1689（2015）10—1101—06

2014-09-17

贵州省遵义市中药重大专项赤中药科合（201306）。

李明元（1965—），男，四川泸州人，农学博士，教授，主要从事食品质量安全及营养保健研究。E-mail：limingyuan 519@qq.com