黑曲霉菌降解黄曲霉毒素B1的影响因素的研究

陈志辉，徐馨，李仲玉，程宝晶，*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030；2.黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔161000）

黑曲霉菌降解黄曲霉毒素B1的影响因素的研究

陈志辉1，徐馨2，李仲玉1，程宝晶1，*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030；2.黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔161000）

谷物类原料因保管不善造成或加工过程中操作不当易产生大量黄曲霉毒素B1。目前，微生物法已成为降解黄曲霉毒素B1的研究热点。本研究用已筛选出具有降解黄曲霉毒素B1能力的黑曲霉菌为研究对象，从发酵液不同处理方式，热稳定性，pH稳定性，金属离子稳定性等方面，对其降解的影响因素进行了研究。通过对其发酵液不同处理途径和不同条件对其降解黄曲霉毒素B1能力的影响的研究，初步判断筛选菌株是通过直接代谢和分泌胞外酶两种途径共同降解黄曲霉毒素B1的，而分泌胞外酶又是其主要的降解黄曲霉毒素B1的手段，因此易受温度、pH、和金属离子的影响。

黄曲霉毒素B1；降解；黑曲霉菌；影响因素

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是由寄生曲霉和黄曲霉产生的具有强烈毒性的次生代谢产物，也是目前所有发现真菌类毒素中毒性最大的［1］。AFB1毒性是氰化钾100倍，致癌作用是已知化学致癌物中最强的，致癌性比二甲基亚硝胺强75倍［2-3］。AFB1污染范围广泛，可发生在粮食、油料、干果、调味品、乳制品、肉类上，尤其以谷物原料最易受到污染，如果这些受到污染严重食物原料进入到流通环节将严重威胁到消费者的健康［4］。目前，微生物法以其节能、环保等优点，已成为去除或降低谷物原料中AFB1毒性的研究热点［5］，但其降解的影响因素还不甚明了。本研究用本实验室已筛选出的具有降解AFB1能力的黑曲霉菌为研究对象，从发酵液不同处理方式，热稳定性，pH稳定性，金属离子稳定性等方面，对其降解的影响因素进行了研究。通过对其发酵液不同处理方式和不同因素对其降解AFB1能力的影响的研究，以其为更好利用微生物降解谷物原料中的AFB1，减少其对人类健康的威胁，为微生物法降解AFB1能够在工业生产中广泛应用提供理论支持和科学参考。

1材料与方法

1.1材料

实验菌株为本实验室自行筛选具有较好降解AFB1能力的一株黑曲霉菌（Aspergillus niger）。筛选菌株经PDA琼脂培养基活化，挑取生长较好菌落，接种于NB培养基，扩大培养24 h后，按3%接种于改良的马丁氏培养基中，在34℃，pH 5.5，转速160 r/min的条件下培养48 h。

菌株发酵选用改良的马丁氏培养基，配方为：淀粉40.0 g；胰蛋白胨5.0 g；酵母膏2.0 g；磷酸氢二钾1.0 g；硫酸镁0.5 g；去离子水1 000 mL；pH 5.5，121℃灭菌20 min。

AFB1标准品购自美国Sigma公司；AFB1采用ELISA法测定，试剂盒购自北京百林康源公司。

1.2方法

1.2.1不同处理方式发酵液降解效果的比较

实验各分组方式见表1，空白组仅添加AFB1（使终浓度为10 μg/L，下同）；对照组既添加AFB1同时又接种筛选菌（接种量3%），其余3组处理方式如表1所示。

表1　各分组处理方式Table 1Approach of each group

将5组在32℃，200 r/min条件下摇床培养24 h。发酵培养后，对仅接种筛选菌的3组进行再处理后，分别检测各组对AFB1的降解率。

1.2.2温度对发酵上清液降解效果的影响

1）高温处理对离心上清液降解AFB1的影响。取1.2.1离心上清液，分别置于50℃和60℃水浴锅中，保存2、4h和6h，取出后迅速置于冷水冷却，添加AFB1，32℃，pH 6.0，200 r/min培养24 h，检测AFB1降解率。

2）不同温度对离心上清液降解AFB1效果的影响。取1.2.1离心上清液添加AFB1，分别在20、25、30、 35、40、45℃和50℃条件下，pH 6.0，200 r/min培养24 h，检测AFB1降解率。

1.2.3pH对发酵上清液降解效果的影响

1）不同pH处理对离心上清液降解AFB1的影响。取1.2.1离心上清液，分别调节pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，4℃下放置3 h和6 h后，添加AFB1，32℃，pH 6.0，200 r/min培养24 h，检测AFB1降解率。

2）不同pH对离心上清液降解AFB1效果的影响。取1.2.1离心上清液添加AFB1，分别在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0条件下，32℃，pH 6.0，200 r/min培养24 h，检测AFB1的降解率。

1.2.4金属离子对发酵上清液降解效果的影响

取1.2.1中离心上清液，添加AFB1，同时添加金属离子（Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+、Fe2+、Fe3+），使其浓度均为c=5.0 mmol/L，32℃，200 r/min培养24 h，检测AFB1降解率。

2结果与分析

2.1不同处理方式发酵液降解AFB1效果的比较

不同处理方式发酵液对AFB1的降解效果见表2。

表2　培养液不同处理方式对AFB1降解率的影响Table 2Degradation rate of AFB1by different approach of fermentation broth

发酵液加热灭活24h内对AFB1的降解率为5.9%、发酵液离心获得的的上清液为43.4%，离心沉淀物经超声破碎后重新溶解液为0.8%，而空白组和对照组则分别为0.0%和58.4%，从结果可以发现，3个处理组都达不到同时间活菌对照组的对AFB1降解率。降解效果分别只达到了对照组的10.1%、74.3%、1.4%。3个处理组降解率之和也仅为活菌对照组的85.8%，但其离心上清液仍然是主要降解源。

2.2温度对离心上清液降解AFB1效果的影响

由表3可知，离心上清液AFB1降解率随热处理时间延长而降低；而且60℃处理组降解率下降幅度要高于50℃处理组，说明离心上清液对AFB1降解热稳定性差，在温度较高比较容易失去降解能力。

离心上清液在不同温度条件下对AFB1的降解率见表4。

由表可知，35℃以下时降解率随着反应温度增大，AFB1的降解率随之增加，而35℃后降解率则快速下降，因此，发酵上清液降解AFB1受温度影响较大，而且35℃为离心上清液降解AFB1的最适温度。

表3　高温处理对离心上清液AFB1降解率的影响Table 3Effect of high temperature of the supernatant on degradation of AFB1%

表4　不同温度处理对离心上清液降解AFB1的影响Table 4Effect of different temperatures on the supernatant degradation rate of AFB1%

2.3pH对离心上清液降解AFB1效果的影响

pH对离心上清液降解AFB1效果的影响见表5。

表5　不同pH处理对离心上清液降解AFB1的影响Table 5Effect of different pH of the supernatant on degradation rate of AFB1%

如表5所示，在pH呈弱碱性条件下（pH=7.0～9.0）时，离心上清液相对稳定，处理3 h与处理6 h对其降解率的影响不大；pH<6.0时，离心上清液的降解效果较差，并且，其降解效果随pH的降低和处理时间的加长而迅速下降。

由表6可知，pH<6.0时，离心上清液对AFB1的降解率迅速降低；pH>6.0时，对AFB1的降解率变化较为平缓缓慢，其中pH=6.0时，降解率最高。

2.4金属离子对离心上清液降解AFB1效果的影响

不同金属离子对离心上清液降解能力的影响见表7。

表6　不同pH对离心上清液降解AFB1的影响Table 6Effect of different pH of the supernatant on degradation rate of AFB1%

表7　添加金属离子对离心上清液降解AFB1的影响Table 7Effect of different metal ion of the supernatant on degradation rate of AFB1

不同金属离子对离心上清液的影响不尽相同，在c=5.0 mmol/L的浓度下，Li+、Na+、K+等碱金属离子对可略微降低其降解能力；除Mn+2外，大多数二价阳离子对其降解能力均有较强的抑制作用；而Pb2+、Cu2+和Fe3+则对其表现出强烈的抑制作用。

3结论与讨论

为研究筛选黑曲霉菌的降解AFB1的影响因素，本试验对发酵液进行了5种不同的处理方式。从试验结果看，对照组的降解率最高，离心上清组、加热灭活组、离心沉淀组均低于对照组但也有一定的降解能力，说明黑曲霉菌对AFB1的降解是一个综合的生物过程，而这3组降解能力之和也略低于对照组，可能是因为黑曲霉菌在生长过程中对AFB1存在一定的代谢能力。离心上清组的降解能力远高于加热灭活组，这可能是因为黑曲霉菌对AFB1降解主要是通过一种热不稳定的生物活性物质来实现的，初步猜测是一种胞外酶，而发酵上清液也是筛选菌株降解AFB1的主要场所。加热灭活组、离心沉淀组也有一定的降解能力，说明在黑曲霉菌降解AFB1的过程中还有一部分非蛋白类物质和胞内酶的存在，这可能与黑曲霉菌代谢AFB1有关。但在本试验中还发现，各处理组降解能力之和依然低于活菌对照组的降解能力，说明在发酵降解过程中，有一部分AFB1可能是通过被筛选菌株直接代谢降解掉的。

蛋白质功能性会受到温度、pH和金属离子影响。温度过低会降低酶促反应k值，从而降低整个酶解反应；温度过高又会造成蛋白变性，使蛋白功能缺失。pH高低又会因为蛋白等电点不同，而使蛋白空间结构发生改变，进而使其生物学活性降低［6］。金属离子又是条件酶活性的重要物质，对酶的生物活性起到激活或抑制作用［7］。在以往研究中，经常研究活性物质是否会受到以上3个条件影响来判断该生物活性物质是否为一种酶。因此，本试验为进一步确定发酵上清液中的具有降解AFB1的活性物质是否为一种胞外酶，也针对这3个条件对离心上清液降解能力的影响进行了研究。

本研究结果发现，随着反应温度增大，离心上清液中的AFB1降解率随之增加，35℃为其最适作用温度。温度在30℃以下时，低温时降解活性受抑制，而温度升至40℃以上，其降解能力迅速下降；随着热处理时间延长，AFB1的降解率随之降低；且温度越高，活性丧失越严重，降解率越低。在60℃下处理6 h，保留了未处理前7%的活力，说明其对温度较为敏感。

离心上清液的最适反应pH为6.0～7.0，在酸性或过碱性条件下活性均较低。尤其是当pH低于5时，酶活性降到不足最高活性的50%，这可能是由于pH下降，降低到了该酶的等电点，使其发生部分变性引起的；发酵上清液在pH呈弱碱性条件下（pH 7.0～9.0）时相对稳定，pH小于6.0时活性迅速降低，这可能是由于pH降低，引起该酶空间结构发生变化，部分变性，从而导致活性降低。

有研究表明，Ca2+、Mg2+能明显促进黄色短杆菌去除毒素［8］。朱新贵等（2010）也得出结论添加Ca2+和Mg2+可促进枯草杆菌对AFB1的去除［9］。本试验中，离心上清液中添加不同金属离子对该降解酶的活力的影响有很大差异，在c=5.0 mmol/L的浓度下，一价碱金属离子对其活性影响不显著；除Mn2+外，大多数二价离子对酶活均有较强的抑制作用；而Pb2+、Cu2+和Fe3+则对其表现出强烈的抑制作用，这可能是由于重金属使酶发生变性或者高价态离子使其氧化变性所致。而且与其他人所得到的结果不同［10-11］，本试验中所有的金属离子均对酶活有不同程度的抑制作用，说明本试验中的降解酶受在高金属离子浓度的条件下受到负向调控。

在本试验中，离心上清液作为筛选菌株降解AFB1的主要场所，其降解能力较易受到温度、pH和金属离子的影响，而这与功能性蛋白的特性十分相近，因此判断本试验的筛选菌株是通过向发酵液中分泌胞外酶的途径来降解AFB1的。

在本试验中，活菌对照组对AFB1的降解能力高于其它各处理组之和，综合以上研究推测，原因可能是筛选菌株将一部分降解后的AFB1产物吸收到菌体内作为其生命活动的碳来源，而降解产物的减少又催化胞外降解酶降解了更多的AFB1底物，而在单独使用发酵上清液处理AFB1时，由于缺少了活菌对降解产物的代谢，使酶解反应更容易达到平衡，造成其降解能力低于活菌对照组。因此，在未来的试验中，如何建设AFB1的酶解产物，进一步增加其降解率，是除了发酵降解条件优化外，提高本试验中筛选菌株降解AFB1的另外一个有效的研究方向。

［1］Shouman BO，ElMorsi D and Shabaan S.Aflatoxin B1 level in relation to child's feeding and growth［J］.Indian journal of pediatrics，2012，79（1）：56-61

［2］Cuccioloni M，Mozzicafreddo M and Barocci S.Aflatoxin B1 misregulates the activity of serine proteases：possible implications in the toxicity of some mycotoxin［J］.Toxicology in vitro，2009，23（3）：393-399

［3］Alpsoy L，Agar G and Ikbal M.Protective role of vitamins A，C and E against the genotoxic damage induced by aflatoxin B1 in cultured human lymphocytes［J］.Toxicology and Industrial Health，2009，25（3）：183-188

［4］Mezeal IA.Detection of Presence Fungi and Aflatoxines（AFB1 and AFG1）in Rice Samples Collected from Maysan Province［J］.Journal of Biology，Agriculture and Healthcare，2015，5（7）：10-16

［5］Meca G，Roig M and Ferrer E.Degradation of the bioactive compounds enniatins A，A1，B，B1 employing different strains of bacillus subtilis［J］.Food Processing&Technology，2014，5（6）：334-343

［6］李超波，李文明，杨文华.黄曲霉毒素B1降解菌分离鉴定及其降解特性［J］.微生物学报，2012，52（9）：1129-1136

［7］Chowdhury SR，Basak RK.，Sen R.Optimization，dynamics，and enhanced production of a free radical scavenging extracellular polysaccharide（EPS）from hydrodynamic sediment attached Bacillus megaterium RB-05［J］.Carbohydrate Polymers，2011，86（3）：1327-1335

［8］Nicolas Vazquez I，Mendez Albores A and Moreno Martinez E.Role of lactone ring in structural，electronic，and reactivity properties of aflatoxin B1：a theoretical study［J］.Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2010，59（3）：393-406

［9］朱新贵，林捷.几种食品微生物降解黄曲霉毒素作用研究［J］.食品科学，2010，22（10）：65-68

［10］Krishnamurthy YL，Shashikala J and Shankar Naik B.Antifungal potential of some natural products against Aspergillus flavus in soybean seeds during storage［J］.Journal of Stored Products，2008，44（4）：305-309

［11］Dimitrokallis V，Meimaroglou DM，Markaki P et al.Study of the Ochratoxin A effect on Aspergillus parasiticus growth and aflatoxin B1production［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46（7）：2435-2439

Study on the Effect Factors of Degradation of Aflatoxin B1by Aspergillus Niger

CHEN Zhi-hui1，XU Xin2，LI Zhong-yu1，CHENG Bao-jing1，*
（1.College of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161000，Heilongjiang，China）

Aflatoxin B1（AFB1），as a kind of mycotoxin produced by Aspergillus spp.，was a highly toxic substance and widely distributed in food matrix.Microbiological was major research method of the degradation of AFB1.The study use screened Aspergillus niger which can degrade AFB1，through different treatment of fermentation broth，thermal stability，pH stability，and the stability of the metal ions of the fermentation broth，to research the effect factors of AFB1degradation.Through its fermentation broth different handling methods and different conditions of its degradation of AFB1ability of research，initially determine the screening strains by metabolism and secretion of extracellular enzymes to degrade AFB1，while the secretion of extracellular enzymes is main means of AFB1degradation.

Aflatoxin B1；degradation；Aspergillus niger；effect factors

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.028

2013-12-07

国家自然科学基金项目（No.31072046）；现代化农业体现项目（CARS-36）

陈志辉（1980—），男（汉），实验师，硕士，研究方向：动物营养与饲料科学。