液质联用法快速测定饲料中维吉尼亚霉素含量

曹文卿，吴振兴，静平，杨桂朋，林黎明

（1.中国海洋大学化学化工学院，山东青岛266100；2.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东青岛266002）

液质联用法快速测定饲料中维吉尼亚霉素含量

曹文卿1，2，吴振兴2，静平2，杨桂朋1，林黎明2

（1.中国海洋大学化学化工学院，山东青岛266100；2.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东青岛266002）

建立了饲料中快速测定维吉尼亚霉素M1和S1残留量的高效液相色谱-质谱/质谱（HPLC-MS/MS）方法。样品采用乙腈提取，经冷冻脱脂和饱和氯化钠溶液盐析净化，用甲醇-甲酸铵溶液定容，经SDB-C8色谱柱分离后，采用多反应监测（MRM）正离子模式检测，监测离子对分别为M1：m/z 526.3/355.1和526.3/337.2；S1：824.5/290.1和824.5/ 205.1。其中526.3/355.1和824.5/205.1分别用于M1和S1的外标法定量。维吉尼亚霉素M1和S1在1.0 μg/kg～1 000.0 μg/kg范围内线性关系良好，相关系数为0.998 7～0.999 5，添加饲料中添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg时，回收率在81.0%～105.0%之间，相对标准偏差（RSD）均小于4.0%（n=6），最低检出限和定量限分别为1.0 μg/kg和2.0 μg/kg。实验结果表明，该方法准确度高，省时，操作简单，成本低，重现性好，结果可靠，实用性强。

维吉尼亚霉素M1和S1；高效液相色谱-质谱/质谱；乙腈提取；冷冻脱脂；盐析净化；饲料；快速测定

维吉尼亚霉素（Virginiamycin，简称VGM）又称维吉尼霉素、速大肥、肥大霉素、维及霉素、抗金霉素或抗金葡霉素和威里霉素等，是维吉尼链霉菌产生的一种内酯环肽类抗生素，它是由VGM M（M1，M2）和VGM S（S1～S5）组成的混合物，其中VGM M1和VGM S1为主要成分，分子式分别为C28H35N3O7和C43H49N7O10，结构式见图1，它们各有不同的抗菌范围，并存在较好的协同性，按一定比例配合具有很好的抗菌效果。商业维吉尼亚霉素为M1和S1的混合物，一般比例为3∶1。

图1　维吉尼亚霉素M1和S1的结构式Fig.1Chemical structures of virginiamycin M1and S1

维吉尼亚霉素主要对革兰氏阳性菌有抑制作用，主要通过抑制细菌核糖体合成蛋白质达到杀菌效果，可以防治细菌性下痢和鸡坏死性肠炎［1］；还能杀灭肠道中有害细菌，减少乳酸、氨、挥发性脂肪酸等毒素的产生，减缓肠道蠕动，从而延长饲料在肠道中的消化时间，起到增强动物对营养物质的消化和吸收，促进生长发育的作用［2-6］。美、欧国家曾将维吉尼亚霉素作为“动物生长促进剂”广泛用于畜禽配合饲料中。为充分降低发生细菌抗药性危险程度，欧盟1999年决定禁止将维吉尼亚霉素、杆菌肽锌、磷酸泰乐菌素等抗生素作为动物生长促进剂用于饲料添加剂。我国农业部在2001年发布的《饲料药物添加剂使用规范》允许将维吉尼亚霉素用于饲料添加剂，用来防病和促生长。农业部2002年235号公告规定：维吉尼亚霉素在鸡组织中的最高残留限量，肌肉为100 μg/kg，肝脏为300 μg/kg，肾脏为400 μg/kg［7］，2011年国家质检总局下达的残留监控计划中，出口欧盟的鸡产品限量为1.0 μg/kg，进口羊组织中维吉尼亚霉素限量为50 μg/kg。目前饲料中检测维吉尼亚霉素残留主要用高效液相色谱法［8-10］，检测限在1mg/kg以上，食品中检测维吉尼亚霉素残留主要在奶制品、猪组织中以检VGM M1为主，前处理方法使用甲醇-乙腈提取样品，C18SPE固相萃取小柱净化后，再用三氯甲烷萃取洗脱液，操作繁杂，国家标准方法中检测限在2.0 μg/kg左右，液-质分析谱图出峰时间较迟（22 min～24 min之后），分析一个样品至少需0.5 h［11-17］。本文参照文献［18］研究并建立一种快速检测饲料中维吉尼亚霉素M1和S1的简单高效方法，前处理直接采用乙腈提取，经冷冻脱脂和饱和氯化钠溶液盐析净化，无须使用SPE小柱和三氯甲烷等材料即可达到净化要求；既环保、节约，又缩短了前处理时间，仪器分析效率亦提高一倍（共15 min），结果可靠，回收率高，可同时对饲料中的维吉尼亚霉素M1和S1含量进行快速测定，定量限为2.0 μg/kg，满足当前对饲料制品中此类药物含量的控制要求。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Agilent 6410高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）及MssHunter3.0数据处理系统：美国Agilent公司；T25型均质器：IKA公司；39760型涡流混匀器：Thermolyne公司；KQ-500DB型超声波发生器：昆山超声仪器有限公司；振荡器；HITACHI高速冷冻离心机：GR22GⅡ，日本；MilliQ超纯水仪：Millipore公司；氮吹仪：美国Caliper公司，0.22 μm微孔滤膜、十万分之一分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；磷酸二氢铵、甲酸铵、氯化钠：优级纯；甲酸为色谱纯：德国Merck公司；水为超纯水（18.2 MΩ·cm）、维吉尼亚霉素M1（纯度98%）、S1（纯度99%）：美国Sigma公司。

1.2标准溶液的配制

精密称取维吉尼亚霉素M1和S1标准品各10.0± 0.2 mg用乙腈溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的标准储备液（-18℃以下保存）。用乙腈稀释成10 μg/mL的标准中间液（-18℃以下保存）。使用前用乙腈将标准中间液稀释成适当浓度的标准工作液。

1.3样品前处理

称取（1.00±0.01）g粉碎均匀的饲料样品于50 mL聚丙烯离心管中，准确加入10 mL乙腈，均质3 min，振荡提取10 min，4℃下以3 000 r/min冷冻离心10 min，转移上清液到另一洁净离心管中；残渣加入10 mL 0.01 mol/L NH4H2PO4缓冲液，涡旋混匀后振荡10 min，4℃下，8 000 r/min离心10 min，合并上清液并涡旋混匀，8 000 r/min离心5 min，上清液待净化。

在上述提取液中加入3.7 g氯化钠振荡5 min，在-5℃下，12 000 r/min离心10 min后从乙腈层吸取5 mL至15 mL玻璃管中，45℃下氮气吹干。加入0.5 mL甲醇和甲酸铵混合液（1∶1，体积比）溶解残渣，定容液转移至2 mL EP管中，4℃下，12 000 r/min离心10 min，上清液过双层0.22 μm注射器滤膜（有机膜）至棕色进样小瓶中，供HPLC-MS/MS测定。

1.4液相色谱

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A：乙腈；B：3 mmol/L甲酸铵水溶液，梯度洗脱（柱平衡时间4 min）：0 min～2 min，50%A～75% A，2 min～3 min，75%A～80%A，3 min～6 min，80%A～85%A，6 min～8 min，85%A～50%A，8 min～12 min，保持50%A；流速：500 μL/min；柱温：25℃；进样量：10 μL。

1.5质谱条件

电喷雾离子源（ESI+）；毛细管电压：4 000 V；干燥气流量：10.0 L/min；雾化器压力：211 KPa；干燥气温度：350℃；多离子反应监测（MRM）；定性离子、定量离子、保留时间、驻留时间、碰撞电能和碰撞电压等参数见表1。

表1　维吉尼亚霉素M1、S1的HPLC-MS/MS多反应监测参数Table 1The HPLC-MS/MS parameters of VGM M1and VGM S1in multiple reaction monitoring（MRM）

2结果与讨论

2.1质谱条件的优化

从质谱全扫描得到一级质谱图维吉尼亚霉素M1和S1的分子离子分别为526.3和824.5；再分别以M1和S1的分子离子为母离子进行子离子扫描，得到相应子离子：355.1、337.2，290.1、205.1；每种化合物选取两个离子对，并将丰度最高的526.3/355.1和824.5/205.1分别作为M1和S1的定量离子。优化碎裂电压（Fragmentor）和碰撞能（CE）（优化的参数见表1）。

2.2色谱条件的优化

分别选用甲醇：乙腈（体积比=1∶1）-0.1%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L的乙酸铵水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-3 mmol/L的甲酸铵水溶液为流动相。并进行梯度洗脱。结果表明，在该仪器条件下，乙腈-3 mmol/L的甲酸铵水溶液为流动相时，采用（1.4）的梯度程序，维吉尼亚霉素M1和S1得到较好分离，且保留时间适宜（分别为5.3 min和6.5 min附近，待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围在±0.25 min之内，图2），峰形良好，各基质总离子流图（图3）与提取液质谱图中无明显干扰峰（图4）。在色谱条件最优化条件下标准溶液、空白基质溶液和加标饲料样品提取液的总离子流图及提取离子流图见图2～图4。

图2　维吉尼亚霉素M1、S1标准品的总离子流图和提取离子图Fig.2MS Spectrum TIC&EIC of Virginiamycin M1&S1

图3　饲料样品中维吉尼亚霉素M1、S1的总离子流图Fig.3MS Spectrum TIC of Virginiamycin M1&S1in feed samples

2.3提取与净化方法的改进

根据目标化合物的物理化学性质，改进提取方法需要解决的两个问题：一是选择的提取溶液必须能将目标物有效提取；二是能使基质干扰较少。分别用水、甲醇、乙腈及其不同比例的混合物进行了比较实验。结果发现，使用水和甲醇作提取液比用乙腈提取出更多的基质干扰物，同时目标物回收率也较低，而乙腈能有效提取出样品中的目标物，因此选取乙腈为提取溶剂，同时利用饱和氯化钠的盐析作用使杂质进一步析出并使乙腈与水相分层，具有提取净化的双重作用，由于净化比较充分，本方法不需使用SPE净化步骤。

图4　加标饲料样品中维吉尼亚霉素M1、S1的提取离子流图（2.0 μg/kg）Fig.4Extracted Chromatograms of Virginiamycin M1，S1from spiked feed sample（2.0 μg/kg）

实验发现提取步骤中两次提取液在合并后由澄清变浑浊，是因为溶液的pH发生变化，使杂质的溶解度降低而析出所导致。为减少检测干扰，提取液合并后混匀后须再次离心以分离析出物。

2.4方法的线性范围

用初始流动相和标准工作液配制0、1.0、2.0、10.0、100.0、1 000.0μg/kg基质校准曲线，以标准物质峰面积为纵坐标，以标准工作溶液浓度（μg/kg）为横坐标，绘制标准曲线，外标法定量，所得回归参数见表2。

表2　维吉尼亚霉素M1、S1在添加水平为1.0 μg/kg～1 000.0 μg/kg时校准曲线的相关参数Table 2Calibration curve parameters in fortified feed samples at range of 1.0 μg/kg-1 000.0 μg/kg

结果表明，维吉尼亚霉素M1、S1在1.0 μg/mL～1 000.0 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.5最低检测限测定

称取饲料样品1.0 g（精确到0.01 g），加入适量标准液，使样品中维吉尼亚霉素M1、S1的浓度水平为1.0、2.0、5.0 μg/kg，每水平3个平行样，按1.3.2处理后进HPLC-MS/MS测定。添加水平为1.0 μg/kg的提取液中的维吉尼亚霉素M1的定性定量离子信噪比均≥10，S1定量离子信噪比大于3；添加水平为2.0 μg/kg的溶液，测得其目标化合物定量离子M1和S1的S/N皆大于10，维吉尼亚霉素M1&S1的检出限测定参数见表3。

表3　维吉尼亚霉素M1&S1的检出限测定参数Table 3Signal-to-Noise ratios in determination of VGM M1&S1in feed sample by HPLC-MS/MS（spiked level at 1.0 μg/kg（LOD）&2.0 μg/kg（LOQ））

以被测化合物的相应值信噪比≥3和≥10时所对应的含量分别作为检测限和定量限，表明维吉尼亚霉素两种主要成分的检出限和定量限分别达到1.0 μg/kg和2.0 μg/kg.方法灵敏度满足目前此类化合物的检测技术指标要求。

2.6应用本方法对饲料样品前处理的效果

采用本研究方法对空白饲料样品做维吉尼亚霉素M1、S1的空白提取和加标回收实验，得到相应质谱图。经本方法处理的样品谱图基质干扰较小的效果见图3。

2.7方法的回收率和精密度

等量称取18个（1.00±0.01）g阴性饲料样品于50mL聚丙烯离心管中，分为3组，分别加入适量标准工作液，使3组样品中维吉尼亚霉素M1、S1的含量分别为2.0、5.0、10.0 μg/kg，加标样品按步骤1.3.2处理后进HPLC-MS/MS测定。基质匹配标准工作曲线法进行外标法定量，回收率和精密度数据见表4。

表4　加标饲料样品的平均回收率和精密度实验结果（n=18）Table 4The average recoveries and of precisions of virginiamycin M1&S1in fortified feed samples（n=18）

在添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg时，维吉尼亚霉素M1和S1的平均回收率分别为M1：94.0%～103.2%，97.0%～102.0%，89.2%～105.0%；S1：92.4%～99.8%，85.2%～92.8%，81.0%～91.9%。用空白基质进行室内精密度试验，在添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg时，维吉尼亚霉素M1的总体变异系数分别为：3.5%；2.0%；4.0%；S1的总体变异系数分别为：3.3%；3.9%；2.6%。加标饲料样品的平均回收率和精密度实验结果见表4。

3结论

本文建立了快速检测饲料中维吉尼亚霉素M1和S1含量的高效液相色谱-质谱/质谱检测方法，样品处理过程采用乙腈直接提取，饱和氯化钠溶液盐析净化，方法操作简单，准确度高，低成本，省时高效。与目前流行的甲醇提取和SPE净化方法相比，该方法明显改进了基质效应问题，且具有灵敏度高、重现性好、结果可靠的优点，完全满足目前我国目前饲料产品中维吉尼亚霉素含量监控的技术要求。

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A Rapid Method for the Determination of Virginiamycin in Feeds Using Liquid Chromatographytandem Mass Spectrometry

CAO Wen-qing1，2，WU Zhen-xing2，JING Ping2，YANG Gui-peng1，LIN Li-ming2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering of OUC，Qingdao 266100，Shandong，China；2.Shandong Exit-Entry Inspection and Quarantine Technical Center，Qingdao 266002，Shandong，China）

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric（HPLC-MS/MS）method was developed for the determination of virginiamycin（VGM）M1and S1residues in feeds.The samples were extracted with acetonitrile，purified by freezing de-fatted and salting-out effect of saturated sodium chloride solution and redissolved in methanol-ammonium formate solution.The extracts were separated with XDB-C8 LC column using a binary eluent under gradient elution and determined by tandem mass spectrometry under positive electrospray ionization mode with multiple reaction monitoring（MRM）mode.m/z M1：526.3/355.1 and 526.3/337.2，S1：824.5/290.1 and 824.5/205.1 were selected as precursor-product ion pairs，in which 526.3/ 355.1 and 824.5/205.1 were used for external standard quantization.Under the optimal conditions，the calibration curve was linear over the concentration of VGM in the range of 1.0 μg/kg-1 000.0 μg/kg with correlation coefficient between 0.998 7-0.999 5.The quantitation limit of 2.0 μg/kg and the detection limit was 1.0 μg/kg.The average fortified recoveries of VGM from feeds at 3 spiked levels of 2.0，5.0 and 10 μg/kg ranged from 81.0%to 105.0%with relative standard deviations（RSD）（n=6）less than 4.0%.The method showed good simplicity，sensitivity，stability，accuracy，time saving and low cost，and was suitable for the rapid determination of VGM in feedstuffs.

VGM M1and S1；HPLC-MS/MS；acetonitrile extraction；freezing de-fatted；salting-out effect；feeds；rapid method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.021

2013-12-17

国家自然科学基金重点项目（NO.41030858）；国家自然科学基金创新研究群体项目（NO.41221004）

曹文卿（1974—），女（汉），工程师，博士研究生，研究方向：生物毒素分析。