效应面法与酶法联用提取天麻素和天麻多糖的优化工艺研究

叶文斌

（陇南师范高等专科学校生化系，甘肃成县742500）

效应面法与酶法联用提取天麻素和天麻多糖的优化工艺研究

叶文斌

（陇南师范高等专科学校生化系，甘肃成县742500）

通过效应面法与酶法联用工艺提取天麻中的活性物质。以天麻素和天麻多糖含量为评价指标，用单因素方差分析法研究酶解温度、酶解浓度和pH对提取天麻素和天麻多糖含量的影响；采用效应面法和对酶法联用提取工艺条件进行优化。结果显示，最佳优化工艺为：酶解温度为54.36℃，酶解浓度为0.09 g和pH为4.73，该工艺条件易于控制、工艺简单，成本低，在此条件下，天麻酶解后天麻素的最高含量为7.281 6 mg/g，天麻多糖的最高含量为38.336 1%。

效应面法；酶法；天麻素；天麻多糖；优化工艺

天麻为兰科天麻属植物天麻（Gastrodia elata Blume）的根茎，是我国名贵的中药之一［1］。天麻的主要有效成分之一为天麻素，即对羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖甙，天麻素有镇静和安眠等作用，为常用安眠镇静药［2-3］，有研究表明天麻素对动脉粥样硬化导致的锥基底动脉供血不足疗效显著［4］。此外还对心脏缺血有保护作用、具有温和的降压作用、拮抗兴奋性氨基酸神经毒性以及对模拟脑缺血再灌注损伤星形胶质细胞有良好的保护作用［5-7］。随着植物多糖在保健和药理方面的研究和应用关注增多，研究天麻多糖在清除自由基、降血压、抗眩晕、抑菌方面具有独特疗效［8］。近年来有关天麻素和天麻多糖提取工艺研究的报道较多，但传统提取工艺时间长提取率低［4，9-10］，单独用复合酶法提取天麻中天麻素提取率相对较高，但是其耗时亦较长［11］。而且在提取工艺的优化时只是对单一成分进行优化设计，使得天麻资源浪费严重。为此，本实验用酶法和响应面法联用，同时对天麻素和天麻多糖两种主要活性成分进行提取工艺优化研究，为节约天麻资源以及天麻的综合开发利用提供实验技术。

1材料与方法

1.1仪器与材料

电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司；SK5200H超声波清洗仪：上海科导超声仪器有限公司；RE52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅：上海千载科技有限公司；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；UV759紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DRT-TW型调温电热套：郑州长城科工贸有限公司；DHG-9036A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精密科学仪器有限公司；1100高效液相色谱色谱仪及检测器、TC-C18色谱柱：Agilent公司。

天麻由甘肃省陇南市康县康麻种植基地提供；天麻素标准品购于贵州迪大科技生物有限公司；苯酚、浓硫酸、葡萄糖（sigam公司），工业用复合酶，酶活构成为：β-葡聚糖酶≥300万kat/mL，纤维素酶≥40万kat/mL，木聚糖酶≥260万kat/mL，果胶酶≥2万kat/mL）和氏璧生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1天麻多糖和天麻素的提取流程

将天麻块茎在50℃烘干后将其粉碎，过40目筛，用无水乙醇回流脱脂，再在50℃时干燥，然后加入一定量的水，在一定温度下添加相应的复合酶进行一定时间的酶解提取，提取液经过减压浓缩得浓缩液，加3倍体积乙醇醇析得粗多糖沉淀，抽滤，沉淀用甲醇多次洗涤，冷冻干燥后得粗多糖样品；在减压浓缩蒸馏出来的液体回收，并和将析后抽滤出来的液体合并，减压回收乙醇和甲醇，使滤液成膏，冷冻干燥后备用，待用时加入适量的蒸馏水溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，HPLC法进样测定天麻素含量。

1.2.2天麻多糖含量的测定方法

本实验采用苯酚-硫酸法［11-12］测定总的天麻多糖含量。本实验先把葡萄糖用苯酚、硫酸试剂处理后，进行紫外扫描，在489 nm处有最大吸收；再利用标准糖浓度和其用苯酚、硫酸试剂处理后在489 nm处的吸光度制作标准曲线，再测定待测样品溶液的吸光度，然后根据回归方程计算相应的浓度从而求出多糖含量。苯酚试液的配制：取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，蒸馏，收集182℃馏分，用时称取6 g，加水溶解，定容于100 mL棕色容量瓶（临用前新配）。取多糖干品10.0 mg，用蒸馏水定容于100 mL容量瓶。吸取1.0 mL于带塞试管中，（按上述步骤操作，测其吸光度，以标准曲线计算精天麻多糖含量。天麻多糖的提取率（%）=样品中多糖的含量稀释倍数/样品干重×100%。

1.3天麻多糖和天麻素的单因素实验

分别称取1.0 g天麻药材粉末多份，分别置于250 mL锥形瓶中，用100 mL蒸馏水混匀，调节pH至4.8，备用。用时添加不同酶剂量搅拌均匀后用保鲜膜封口，置于50℃恒温摇床培养，转速100 r/min，酶解24 h，以蒸馏水为空白对照，实验重复5次。酶解浓度对提取天麻多糖和天麻素的影响：分别加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.12 g工业用复合酶；温度对提取天麻多糖和天麻素的影响：取备用天麻粉末匀质液体加入工业用复合酶0.06 g，温度设置为35、40、45、50、55、60和66℃的恒温培养箱内酶解；pH对提取天麻多糖和天麻素的影响：在备用天麻粉末匀质液体中分别加入工业用复合酶0.06 g，以1 mol/L CH3COOH溶液和1 mol/LNaOH溶液调节成pH值分别为4.4、4.6、4.7、4.8、5.0、5.2、5.5和6.0的系列梯度进行实验。各单因素实验后测定天麻多糖和天麻素，来确定适合的单因素条件。

2结果与分析

2.1多糖测定标准曲线的确立［11-12］

在实验条件下，以标准液浓度（mg/mL）为横坐标，为吸光度值为纵坐标，得标准曲线，计算回归方程：y= 5.109 6x+0.007 3，相关系数R2=0.999 6，线性良好。

2.2色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.2%磷酸水和30%乙腈（v/v），洗脱：50 min，柱温60℃，流速：1.0 mL/min；进样量：25 μL；检测波长：221 nm。天麻素标准曲线Y=5.6 x-9515.57，R2= 0.999 5，最低检测限位1.0 μg；制备测定天麻素含量的样品5份，连续进样，测量峰面积值，计算各单糖的RSD（n=5）为0.83%，回收率为95.83%，说明精密度良好。由图1可知，天麻对照品的保留时间为8.784min，由图2可知，天麻提取液中含有天麻素，且天麻素提取液中的天麻素保留时间为8.659 min。

2.3影响天麻多糖和天麻素的单因素实验

不同的酶解温度对天麻多糖溶出率和天麻素的影响见图3。

图1　天麻素标准品色谱Fig.1HPLC of the standard gastrodine

图2　天麻提取液中天麻素色谱Fig.2HPLC of the gastrodine

图3　酶解温度对天麻多糖和天麻素含量的影响Fig.3Effect of enzymolysis temperature on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

图4　酶解pH对对天麻多糖和天麻素含量的影响Fig.4Effect of enzymolysis pH on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

由结果分析可知，45℃～55℃天麻多糖和天麻素的提取率之间差异较为明显，而55℃的天麻多糖和天麻素的提取率最高。因此，温度选择在45℃以上，考虑到酶解温度以及能量节约宜选择提取温度为55℃。

从图4中可以得出，天麻多糖和天麻素含量随着溶液的pH的增加呈先增加后减少的趋势。当溶液的pH达到5.0时，两者含量都达到最大值。当溶液的pH超过5.0时，多糖的溶出率和天麻素的含量反而减少，说明这时溶液的pH超过酶的最适pH，活性开始降低，所以最佳pH为5.0。不同酶解浓度对天麻多糖溶出率和天麻素的影响见图5。

图5　酶解浓度对天麻多糖和天麻素含量的影响Fig.5Effect of enzymolysis concentration on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

天麻多糖溶出率和天麻素含量随着复合酶的增加而增加，天麻多糖在酶解浓度为0.06 g处增加明显，天麻素含量在0.08 g以前增加明显，在0.09 g处天麻多糖溶出率和天麻素含量有最大值，此后维持稳定。说明此时酶量足够，已经与底物充分作用，因此复合酶的最佳酶用量为0.09 g。

2.4天麻多糖和天麻素提取工艺条件响应面分析试验结果

以单因素结果为依据，利用Design Expert 8.0.6.1软件设计了三因素三水平的响应面法试验，以酶解温度、酶解浓度和pH为主要考查因素，分别用A、B和C来表示，并以1、0、-1表示自变量的高低水平，以天麻多糖含量与天麻素含量为响应值，表现出20个试验点。因素水平见表1，试验设计、二次回归拟合及方差分析和结果见表2。

表1　天麻素和天麻多糖提取工艺因素与水平Table 1Factors and levels of Box-behnken design

从回归分析中可以得出两者的一次项、二次项均有显著影响。各实验因子对响应值的影响呈显著的线性关系。各实验因子对天麻素（Y1）和天麻多糖（Y2）的响应值的影响分别为：Y1=-741.240 97+8.361 50 A+ 225.559 85 B+219.065 73 C+4.279 17 AB-0.221 62 AC-68.60417BC-0.074445A2-422.92929B2-21.17841C2和Y2=-2 560.057 818+28.803 236 36 A+1 075.321 212 B+761.468 181 8 C+11.983 333 33 AB-0.27AC-191.25BC-0.275 436 364 A2-3 473.232 323 B2-77.397 727 27C2。方差分析结果由表3和4可知，两者的模型都P<0.01说明酶解温度、酶解浓度和pH及其二次项对天麻多糖和天麻素影响极显著，而交互项均无显著影响。天麻素和天麻多糖模型决定系数分别为R2=0.998 0和R2=0.983 2，经拟合检验，天麻素：P= 0.000 7，天麻多糖：P=0.000 1，差异极显著，由此说明两个方程都能很好的反映天麻多糖和天麻素含量与酶解温度、酶解浓度和pH之间的关系，而且根据影响天麻多糖和天麻素提取率大小顺序为B：酶解浓度> A：酶解温度>C：pH。因此，可以应用于天麻多糖和天麻素含量提取的理论预测。依据据回归方程在3个因素的响应面图6～8，相应的响应面均为凹型曲面，说明天麻素和天麻多糖的含量响应值存在着极高值，且响应曲面的等高线中心均位于-1～1之间，说明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。通过分析两者的响应面分析结果可以确定，天麻多糖和天麻素的提取最优工艺参数为：酶解温度为54.36℃，酶解浓度为0.09 g和pH为4.73，在此条件下，天麻酶解后天麻素的最高含量为7.281 6 mg/g，天麻多糖的最高含量为38.336 1%。

表2　天麻素和天麻多糖提取工艺条件设计方案及实验结果Table 2Box-behnken design and results of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

表3　天麻素工艺条件响应曲面模型分析及方差分析Table 3Response surface and ANVOA analysis of gastrodine

表4　天麻多糖工艺条件响应曲面模型分析及方差分析Table 4Response surface and ANVOA analysis of gastrodiae polysaccharides

图6　酶解温度和酶解浓度对天麻素和天麻多糖含量的响应曲面图Fig.6Response surface kyrtograph of enzymolysis concentration and enzymolysis temperature on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

图7　酶解浓度和pH度对天麻素和天麻多糖含量的响应曲面图Fig.7Response surface kyrtograph of enzymolysis concentration and enzymolysis pH on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

图8　酶解温度和pH对天麻素和天麻多糖含量的响应曲面图Fig.8Response surface kyrtograph of enzymolysis temperature and enzymolysis pH on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

3结论

通过酶法和响应面法联用，同时对天麻素和天麻多糖两种主要活性成分进行提取工艺优化研究，两者的响应面分析结果确定了天麻多糖和天麻素的提取最优工艺参数为：酶解温度为54.36℃，酶解浓度为0.09 g和pH为4.73，在此条件下，天麻酶解后天麻素的最高含量为7.281 6 mg/g，天麻多糖的最高含量为38.336 1%。目前提取天麻多糖和天麻素的方法有很多种，包括水浸提法、渗透法、超声法和酶解法［4，9-11］等。传统提取方法主要是水提法，操作繁琐时间长而且提取率相对较低［9-10］。酶解法条件温和，操作简单，节约原材料，有较高的提取率［11］。中药在其提取过程中会因为一些杂质类成分如淀粉、蛋白质、果胶等而影响提取液的质量，而适当的酶通过温和的酶解反应可将液体中杂质出去，从而提高体系澄清度［11］。单独用复合酶法提取天麻中天麻素提取率相对较高，但是其耗时较长，而且酶解法中温度和pH都是影响酶解产物的重要因素，它们不但影响酶的稳定性，而且还影响酶的活性中心必需基团的解离状态和底物的解离状态。在最适pH和温度范围内，底物才能与酶充分的结合，产生大量的产物［11］。所以用响应面法和酶解法联用将天麻中的活性物质天麻素和天麻多糖进行提取工艺的优化时，将温度和pH设计到最佳条件，打破了只是对单一成分进行优化设计，改变了以往提取时天麻资源的严重浪费。而且运用改进的HPLC和多糖测定方法对所提取的活性物质进行测定，确保了实验的精度，为天麻活性成分研究提供了方法保证，对天麻的资源开发和利用具有重要的现实意义。

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Optimization of Enzymolysis Extraction of Gastrodine and Gastrodiae Polysaccharides from Wild Gastrodia elata Blume via Response Surface Methodology

YE Wen-bin
（Department of Life Science and Chemistry，Longnan Teachers College，Chengxian 742500，Gansu，China）

To optimize the technology of enzymolysis and response surface methodology extraction of active material.Used gastrodine and gastrodiae polysaccharides concentration extracted from Wild Gastrodia elata Blume via enzymolysis as experimental assess index，effect of enzymolysis concentration，enzymolysis temperature and pH on gastrodine and gastrodiae polysaccharides extraction were investigated respectively based on single factor variance analysis.Furthermore，its extraction process was optimized based on response surface methodology.In the results that the most optimum enzymolysis extraction processing technology via response surface methodology was as follows：enzyme solution temperature 54.36℃，enzymolysis concentration 0.09 g as well as pH 4.73.The condition of extraction processing technology was easily controlled，simple and lower cost，and the final extraction concentration of gastrodine and gastrodiae polysaccharides was up to 7.281 6 mg/g and 38.336 1%under the processing technology above.

responsesurfacemethodology；enzymolysis；gastrodine；gastrodiaepolysaccharides；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.007

2013-12-05

甘肃省教育厅资助项目（0928B-1）；陇南师范高等专科学校重点项目（2014LSZK01001）

叶文斌（1982—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物化学、果蔬保鲜及植物生理生态。