多重PCR技术快速检测烤后烟叶转基因成分

余婧郭玉双林世锋余世洲赵杰宏

（1.贵州省烟草科学研究院 烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵阳 550081；2.贵州烟叶复烤有限责任公司铜仁复烤厂，铜仁 554300）

多重PCR技术快速检测烤后烟叶转基因成分

余婧1，2郭玉双1林世锋1余世洲1赵杰宏1

（1.贵州省烟草科学研究院 烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵阳 550081；2.贵州烟叶复烤有限责任公司铜仁复烤厂，铜仁 554300）

为提高烟叶转基因成分检测效率，建立了烤后烟叶中3种外源基因成分的多重PCR检测技术体系，通过优化该反应体系中的Mg2+、dNTP、rTaq酶、引物浓度及退火温度等参数，实验最适条件为将4对相等摩尔浓度引物预先按1∶1∶1∶1（V/V）混合，在Mg2+为1.5 mmol/L、dNTP为125 μmol/L、rTaq酶 1 U、混合引物1 μmol/L，DNA 100 ng，退火温度65℃，循环数35个的反应条件下，在一次PCR反应中便可同时检测烟草内源基因NR，外源基因35S启动子、NOS终止子、NPT II筛选标记基因。优化后的反应体系能够有效地检测出转基因烤后烟叶百分比含量为0.9%（V/V）的转基因成分。

多重PCR；烤后烟叶；转基因成分

烟草制品作为特殊消费品，公众对转基因烟草比其他转基因作物更加敏感，烟草作为转基因研究的模式植物，国内外很多科研单位已成功培育抗虫、抗病等多种表现优异的转基因烟草［1］，这些实验材料一旦发生不规范释放和利用，将对消费者利益和我国烟草制品的国际形象造成重大影响。

国际上对烟草转基因检测的遗传元件主要为35S启动子（烟草花叶病毒CaMV 35S启动子）、NOS终止子（农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子）、NPT II筛选标记基因（来自大肠杆菌，编码新霉素磷酸转移酶，卡那霉素抗性的标记基因）［1，2］，我们在对烟草转基因研究中常用遗传元件的筛查中［1］，统计出这3种元件在烟草转基因研究中的使用频率为90%，属于高频使用外源基因元件，在我国，GB/T24310-2009 《烟草及烟草制品 转基因检测方法》［3］将这3种遗传元件作为转基因烟草检测中共有序列标志。因此，在检测烟叶中是否含有转基因成分时，可先行检测35S、NOS、NPT II基因是否存在来确定烟叶中是否含转基因成分。而NR基因为烟草内源基因硝酸还原酶，在PCR检测中用以评价DNA提取质量的可用性［4］。

在转基因检测方法中，PCR方法以其灵敏度高而得到广泛认可，定性PCR技术是转基因检测中最成熟的技术之一，并且多数国家将该方法制定为标准检验方法，但是，大多数定性PCR检测采用单一PCR技术，需分别对每个靶标进行检测，花费时间较多［5］。多重PCR方法是单一PCR方法的改进，该技术在一次PCR反应中同时加入多对引物，只需一次PCR反应便能同时检测两种以上靶标序列，较单一PCR更为快捷和经济［6］，在病毒检测、细菌检测、转基因检测中得到广泛应用［7］。高玉龙等［8］曾提出用于转基因烟草检测的多重PCR方法，但该方法是将35S与NR，NPT II与NOS分别进行二重PCR检测，并未在同一反应内同时实现4种基因成分的检测。本实验以烤后烟叶为供试材料，旨在建立通过一个PCR反应内便能同时检测烟草内源基因NR、外源基因35S启动子、NOS终止子及NPT II筛选标记基因的多重PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 转基因阳性烤后烟叶，非转基因烤后烟叶由本实验室研制提供，其中转基因阳性烟叶为T3代Southern检测单拷贝阳性植株，含NPT II、35S、NOS三种已知转基因成分。烤后烟叶DNA提取参照GB/T 24310-2009《 烟草及烟草制品 转基因检测方法》［3］，DNA浓度统一调至100 ng/μL后，转基因烟叶DNA与非转基因烟叶DNA按1∶99（V/V）比例混合，制成转基因含量为1%的供试DNA。

1.1.2 试剂 rTaqTM（货号R001A，内含A试剂：dNTP mixture，浓度为各2.5 mmol/L，B试剂：10×PCR buffer，Mg2+浓度为15 mmol/L，C试剂：rTaq酶，5 U/μL）、100 bp DNA Ladder Marker、6×Loading Buffer为TaKaRa公司产品，核酸染料GelRedTM10 000×in water为BIOTIUM公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参照国标［3］引物在NCBI中检索基因原序列，通过Primer Premier V5.0设计引物，用软件中的Multiplex/Nested Primers功能，筛选出引物间干扰最小的引物组合，再利用Olige 6.0对设计引物Tm值进行评估，确定最终引物序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 引物序列及扩增产物

1.2.2 单一PCR检测 单一PCR反应体系为：10×PCR buffer 2 μL（Mg2+终 浓 度 1.50 mmol/L），dNTP 1 μL（dNTP终浓度125 μmol/L），上下游引物各1 μmol/L，DNA模板1 μL，rTaq酶0.2 μL，ddH2O补足20 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物加5 μL 6×Loading Buffer，取8 μL经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 多重PCR体系反应体系建立及优化 以上述单一PCR体系为初始反应体系，将4对引物稀释成相等摩尔浓度后预先按1∶1∶1∶1（V/V）混合，对Mg2+、dNTP、rTaq酶和混合引物浓度进行优化，Mg2+浓度：0.75、1.50、2.25、3.00、3.75和4.50 mmol/L；dNTP浓度：100、125、150、175、200、225、250和275 μmol/L；rTaq酶浓度：1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 U；混合引物浓度：0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 μmol/L。反应体系均为20 μL。PCR产物加5 μL 6×Loading Buffer，取8 μL经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 多重PCR反应条件优化 根据1.2.3优化的反应体系，分别对退火温度和循环数进行优化。退火温度梯度：57.5、60.0、62.5、65.0和67.5℃；循环数：27、29、31、33和35个循环。反应体系均为20 μL。PCR产物加5 μL 6×Loading Buffer，取8 μL经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 多重PCR检测限确定 根据1.2.3及1.2.4优化后的多重PCR反应体系及条件，按1.1.1将转基因烟叶DNA及非转基因烟叶DNA混合为转基因成分含量分别为0.9%、0.7%、0.5%、0.3%和0.1%的DNA样品，确定多重PCR的检测限。

2 结果

2.1 单一PCR及引物特异性验证

对转基因及非转基因烟叶内源基因NR的扩增结果（图1）显示，在137 bp处有明显的特异性扩增条带，说明提取的烟叶DNA模板可用于PCR检测。对外源基因NPT II、35S、NOS的扩增结果可知，转基因烟叶分别在约490 bp、345 bp和199 bp处出现明显的特异性扩增条带，而非转基因烟叶未见扩增条带，且空白对照均无条带，说明本实验设计的引物具有较好的特异性，符合PCR检测需要，可用于下步的多重PCR检测试验。

图1 单一PCR扩增结果

2.2 反应体系各组分对多重PCR的影响

在加入不同浓度的Mg2+后，转基因烟叶多重PCR反应扩增结果（图2）显示，泳道2中，在Mg2+浓度为1.5 mmol/L时，4个基因的扩增条件亮度较为一致且清晰可见，而泳道1及泳道6中，Mg2+分别为0.75 mmol/L及4.5 mmol/L时，反应条带非常很弱，基本不可见，而其他泳道中不同Mg2+浓度的扩增效果均没有泳道2理想，说明10×PCR buffer中Mg2+对多重PCR反应影响显著，在Mg2+浓度为1.5 mmol/L时扩增效果最佳。图3结果所示，在泳道1-7中，不同dNTP浓度的扩增条带亮度均较为一致，无显著的非特异性扩增条带，但是，当dNTP浓度达到275 μmol/L时，NPT II及NR基因特异扩增条带可见，但35S及NOS反应条带亮度明显很弱。图4及图5中，rTaq酶浓度及混合引物浓度在一定范围内的变化并未对结果有显著影响，但rTaq酶浓度偏高时，在约600 bp处有非特异性扩增条带出现。

图2 多重PCR中不同Mg2+浓度扩增结果

图3 多重PCR中不同dNTP浓度扩增结果

综合以上因素、实验成本及单一PCR扩增结果，优化后的反应体系为4对引物预先稀释成相等摩尔浓度后按1∶1∶1∶1（V/V）混合，在反应中加入Mg2+1.5 μmol/L、dNTP 125 mol/L、rTaq 1 U、混合引物1 μmol/L。

图4 多重PCR中不同rTaq酶浓度扩增结果

图5 多重PCR中不同混合引物浓度扩增结果

2.3 不同反应条件对多重PCR的影响

图6中，退火温度为65℃时扩增效果最佳，而65℃以下退火温度的扩增效果均不理想，部分条带不清晰，而退火温度为67.5℃时，35S及NOS的特异性扩增条件不可见，这是由于在较高退火温度条件下这两对引物的Tm值较低所致。图7中，35个循环的反应条件为最佳循环数。

图6 多重PCR中不同退火温度扩增结果

图7 多重PCR中不同循环数扩增结果

图8 多重PCR中转基因含量检测限扩增结果

2.4 多重PCR检测限的确定

根据2.2及2.3的多重PCR优化结果，最终确定该反应的最优条件为：体系中加入Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 125 μmol/L、rTaq酶 1 U、混合引物1 μmol/L，DNA 100 ng。反应条件为：退火温度为65℃，循环数35个。为确定本体系的检测限，设置了转基因含量分别为0.9%、0.7%、0.5%、0.3%和0.1%的多重PCR检测，图8中结果所示，在转基因烟叶含量为0.9%的反应体系中，烟草内源基因NR及3个外源基因均得到有效扩增，但在0.7%含量以下时，外源基因目的条带并不明显。因此，该多重PCR反应体系检测限为0.9%。在本体系中，若内源基因NR得不到有效扩增，则表明所提取的烤后烟叶DNA可能含有PCR反应抑制物，即外源基因无特异扩增条带时也不能说明该样品便是转基因阴性的。

3 讨论

多重PCR是在同一体系中加入多对引物进行扩增，不同引物浓度及比例、Mg2+、dNTP等都会对PCR结果造成不同程序的影响，因此设计引物时要充分考虑各引物扩增片段大小、相互干扰、退火退度等，在选择引物时需用分子生物学软件进行筛选，同时需要对反应体系及条件进行优化［9］，由于烤后烟叶DNA降解严重，DNA提取质量是PCR检测的关键［10］，否则会得到假阴性结果，因此用多重PCR检测烤后烟叶转基因成分时，有必要对内源基因同时进行PCR扩增，我们选择了烟草内源硝酸还原酶基因NR作为内源参照基因［3］，以判断所提取DNA是否适于PCR反应。

本实验所建立的多重PCR体系为定性检测，在烤后烟叶转基因检测中具有较好的复重性和稳定性，检测极限为0.9%，而在有关多重定性PCR检测转基因作物的报道中［11，12］，仅对所测靶标进行定性检测，并未明确提出其检测限，在提到检测限的文献中，邱良焱等［5］所建立的多重PCR体系检测限为0.9%，Guo等［13］检测限为80个拷贝，烟草的基因组约10 pg DNA［14］，按此推算，本实验检测灵敏度为90个拷贝，与其他学者的检测极限基本相符。

值得指出的是，使用不同的阳性对照材料对检测极限会有不同极限值，本实验中所使用的转基因阳性烟叶为T3代，Southern检测为单拷贝的材料，但在严格的外源转基因检测中，用于定量的阳性植物材料应是拷贝数单一且稳定，不显示等位基因变化的DNA序列来作为阳性对照［15］，因此，在目前尚未有烤后烟叶转基因PCR检测标准物质的情况下，本实验中的检测极限还需多家单位进行协同实验。

4 结论

以烤后烟叶为材料，建立了在一个PCR反应管内便能同时检测烟草内源基因NR、外源基因35S启动子、NOS终止子及NPT II筛选标记基因的多重PCR方法，初步建立的体系检测限为0.9%（V/V），为烤后烟叶转基因成分筛查提供了技术支撑。

［1］余婧， 张孝廉， 赵丹等. 烟草转基因研究常用遗传元件筛查策略［J］. 中国烟草学报， 2014， 20（1）：78-83.

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［3］中国国家标准化管理委员会. GB/T 24310-2009 烟草及烟草制品转基因检测方法［S］. 北京：中国标准出版社， 2009.

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［5］邱良焱， 肖有玉， 刘佳， 等. 多重PCR法检测转 Bar、Bt 基因双抗稻米［J］. 食品科学， 2013， 34（6）：139-142.

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［13］Guo J， Chen L， Liu X， et al. A multiplex degenerate PCR analytical approach targeting to eight genes for screening GMOs［J］. Food Chemistry， 2012， 132（3）：1566-1573.

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（责任编辑 狄艳红）

A Multiplex PCR for Rapid Detection of Genetically Modified Ingredient in Flue-cured Tobacco

Yu Jing1，2Guo Yushuang1Lin Shifeng1Yu Shizhou1Zhao Jiehong1
（1. Tobacco Molecular Genetics Key Laboratory of China Tobacco，Guizhou Academy of Tobacco Science of CNTC，Guiyang 550081；2. Tongren Factory of Guizhou Tobacco Leaf Redrying Co.，Ltd，Tongren 554300）

In order to improve the efficiency of detecting genetically modified ingredient（GMI）， we established a multiplex PCR detecting 3 exogenous gene ingredients in flue-cured tobacco. By optimizing the concentrations of Mg2+， dNTP， rTaq， and primer as well as annealing temperature in the multiplex PCR system， the result showed that the optimal conditions for the experiment were：4 pairs of primers pre-mixed in ratio of 1∶1∶1∶1（V/V）， Mg2+1. 5 mmol/L， dNTP 125 μmol/L， rTaq polymerase 1 U， mixed primers 1 μmol/L， DNA 100 ng annealing temperature 65℃， and 35 reaction cycles；under the above conditions， the system detected 1 tobacco endogenous gene NR， exogenous gene 35S promoter， NOS terminator and selectable marker NPT II gene by 1 PCR reaction. In this study， the optimized multiplex PCR could efficiently detect the GMI of 0.9%（V/V）in transgenic flue-cured tobacco.

multiplex PCR；flue-cured tobacco；GMO ingredient

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.010

2014-10-30

贵州省科技支撑计划农业攻关［黔科合NY（2013）3020号］

余婧，女，硕士，农艺师，研究方向：烟草转基因检测及烟草生物技术；E-mail：yujingbio@126.com

赵杰宏，男，博士，副研究员，研究方向：烟草生物技术；E-mail：zhaojiehong@126.com