生物技术与我国猕猴桃育种

井赵斌雷玉山李永武

（1.陕西省农村科技开发中心，西安 710054；2.陕西省西安猕猴桃试验站，西安 710054；3.陕西省汉中猕猴桃研究所，汉中 723500）

生物技术与我国猕猴桃育种

井赵斌1，3雷玉山1，2，3李永武2，3

（1.陕西省农村科技开发中心，西安 710054；2.陕西省西安猕猴桃试验站，西安 710054；3.陕西省汉中猕猴桃研究所，汉中 723500）

猕猴桃是原产我国的重要果树之一。随着现代生物技术的发展，以野生和实生选优为主的传统猕猴桃育种方法与以基因组学和转基因为核心的分子育种技术相比，挑战和机遇并存。与其他果树相比，猕猴桃生物技术及其转基因研究较为滞后。就现代生物技术在猕猴桃遗传育种中的方法、应用及研究进展进行了综述，并对我国猕猴桃育种现状进行浅析，旨在为我国猕猴桃育种和产业发展提供方法参考及思路借鉴。

猕猴桃；基因组；转基因；育种

猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）是原产我国的重要果树资源，以其独特的风味，富含维生素C、膳食纤维、多种矿物质等营养成分而成为重要的水果之一［1］。猕猴桃隶属于猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia Lindl.），已发表的相关文献表明，该属共有55种，共约76个分类单元［2］。

以野生和实生表型鉴定、选择，以芽变和杂交等传统育种方法培育新品种已有较长的历史，并将继续在猕猴桃育种中占居不可替代的地位。目前，以基因组学和转基因技术为代表的生物技术为猕猴桃育种开辟了新的途径。本文主要对猕猴桃生物技术研究进展及其在猕猴桃育种和种质资源改良中的应用现状进行综述，旨在为我国猕猴桃育种和产业发展提供参考思路。

1 猕猴桃生物技术研究进展

1.1 基因组学在猕猴桃研究中的应用

1.1.1 基因组资源 通过表达序列标签（EST）测序发掘基因产生了大量的基因组资源。Crowhurst等［3］基于中华猕猴桃（A. chinensis）、软枣猕猴桃（A. arguta）、毛花猕猴桃（A. eriantha）和美味猕猴桃（A.deliciosa）开发了控制风味、色泽、营养成分和成熟性状的ESTs序列共132 577条。截止到2015年7月7日，在GenBank数据库中可以检索到与猕猴桃相关的ESTs和核苷酸序列共193 221条，这些序列主要是基于中华猕猴桃、刺毛猕猴桃（A. setosa）、美味猕猴桃、毛花猕猴桃、软枣猕猴桃、长叶猕猴桃（A.hemsleyana）和葛枣猕猴桃（A. polygama）开发的，其中以果实、叶片、花瓣和叶芽组织居多。基于ESTs数据库开发了许多分子标记，如Zhou等［4］基于中华猕猴桃ESTs数据库，开发了15个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）标记，并利用酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphism sequence，CAPS）方法进行了验证，结果表明这些标记可用于猕猴桃自然群体的遗传变异和进化研究。

1.1.2 分子标记 分子标记已被成功的应用于猕猴桃属物种遗传学研究中，其主要作用表现在两个方面：一是在对种间和种内系统进化关系进行分析的基础上通过系统杂交提高种质资源的利用效率；二是对杂交后代进行辅助选择育种。目前，已有许多分子标记技术用于猕猴桃研究中，如限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、 随 机 扩 增 多 态 性（Random amplified polymorphic，RAPD）、扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、简单重复序列间多态性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）、简 单 重 复 序 列（Simple sequence repeat，SSR）、SNP［5-15］。分子标记在猕猴桃研究中的应用主要表现在两个方面：（1）遗传多样性研究。遗传多样性分析既是人工选择进行群体改良的基础，又是对各种环境条件下最优群体进行分子鉴定的方法，可以为后续杂交亲本选择提供物种遗传信息［16］。Crowhurst等［5］用RFLP标记分析了4个猕猴桃种的亲缘关系，结果表明中华猕猴桃和美味猕猴桃亲缘关系最近，而与毛花猕猴桃和阔叶猕猴桃（A.latifolia）关系较远。Palombi等［17］首次比较了RAPD和SSR标记在微繁美味猕猴桃植株遗传变异中应用效果。Korkovelos等［18］研究发现仅用一个SSR位点就可以区分13个不同基因型的中华猕猴桃。Zhen等［15］利用9个SSR标记对48个猕猴桃栽培品种进行了遗传多样性和亲缘关系分析。Korkovelos等［13］利用8个猕猴桃种对SSR标记的有效性进行了评价，发现二核苷酸序列多带性最高。Mavromatis等［19］利用SSR标记对新选育的猕猴桃新品种进行了分子指纹识别分析。（2）连锁图谱构建和基因定位。Testolin等［9］利用SSRs和AFLP标记结合双假测交作图策略基于中华猕猴桃和硬齿猕猴桃（A.collosa）种间杂交群体构建了第一张猕猴桃连锁图谱。Fraser等［20］利用644个SSRs标记构建了包括29条染色体的中华猕猴桃连锁图谱，该图谱是利用来源于二倍体中华猕猴桃种间杂交的272个个体植株构建的。Novo等［14］基于RAPD和AFLP标记对41株雄花猕猴桃植株花期进行了分析，找到了可用于雄花粉植株选择育种的特异性标记片段。汤佳乐等［21］以抗坏血酸（AsA）含量变异丰富的野生毛花猕猴桃种群为材料，对其叶片和果实中的AsA含量与SSR标记进行了关联分析，获得了5个优异的SSR标记位点。

虽然分子标记用于果树育种的报道已很多，但与育种实践尚有很大的差距。分子标记辅助选择育种是许多研究者对育种工作的设想，但从目前现状来看，对于猕猴桃育种要付之实践需要相当长的时间。我国分子育种具体存在两大问题：一是育种者对分子标记的认识不充分，没有真正理解其作用；二是标记开发数量少、标记与育种目标不匹配，缺乏为猕猴桃育种服务的分子技术平台。随着首个猕猴桃品种红阳基因组测序的完成，分子标记开发的进程将大大加快，预计会进一步推动猕猴桃新品种选育的步伐。

1.1.3 功能基因组和基因组测序 Richardson等［22］用基因表达分析方法研究猕猴桃Hort16A从开花到果实成熟的整个生长过程，结果表明果实形态和生长与模式水果番茄相似，仅在果实成熟过程中存在很大差别。Varkonyi-Gasic等［23］以“Hort16A”为材料研究了猕猴桃花期基因表达情况，明确了猕猴桃花发育的整个分子机理。黄春辉等［23］利用转录组测序技术研究了中华猕猴桃“金丰”的黄肉色泽变化机理，并结合数字基因表达谱（Digital gene expression，DGE）比较分析黄肉猕猴桃在转色前期、转色期和后期的基因表达差异性。Huang等［25］以中华猕猴桃“红阳”为材料，利用IIIumina Hiseq2000高通量测序方法并结合SLAF-seq技术，完成了世界首个猕猴桃基因组测序组装工作，获得140X覆盖度，通过包含4 301个SLAF标记的高密度遗传图谱辅助scaffold序列组装到29个染色体上，获得基因组大小为616.1 Mb，共有39 040个基因。该测序成果的发表为其他猕猴桃物种的基因组测序提供了参考基因组信息，同时可研究种间变异和开发新的SNPs。

1.2 转基因技术在猕猴桃育种中的应用

常规育种方法进行猕猴桃育种周期较长，利用转基因技术培育新品种可以缩短育种时间。猕猴桃转基因技术研究应用主要集中在组织培养技术、遗传转化体系及植株再生等方面。

1.2.1 组织培养技术

1.2.1.1 外植体增殖 Harada等［26］首次报道了利用植物组织培养进行猕猴桃增殖的研究，随后有许多学者基于不同外植体和基因型也进行了研究［27-29］。最常用的增殖培养基是MS。此外，还有Gamborg B5培养基和N6培养基［27，30］。增殖一般包括3个主要流程：首先是用0.5%-1.5%的次氯酸钠进行外植体消毒；第二是在MS培养基上利用外植体（如芽、结面和幼叶）进行茎端增殖，MS培养基中包括2%-3%的蔗糖，0.1-1.0 mg/L的玉米素，0.01-0.1 mg/L的萘乙酸（NAA），0.7的琼脂，pH值为5.8；最后是在包含0.5-1.0 mg/L吲哚乙酸（IBA）的1/2 MS培养基上进行生根。一般条件是在24±2℃培养16 h，光照强度为20-30 μmol/m2/s。研究表明，茎端增殖速率的变化主要取决于物种、外植体类型、植物生长调节剂和培养条件［29］。例如，Kim等［29］利用海沃德800 μm或1 200 μm的横薄切片外植体经过7周获得了2.61倍的增值速率，其培养基为包含了3%蔗糖，4.5×10-3μmol/L的2，4-D，4.6×10-1μmol/L玉米素和0.8%琼脂的1/2 MS培养基，pH值为5.8。

1.2.1.2 原生质体培养和体细胞杂交 雌雄异株和多倍体特性为猕猴桃常规育种带来不便，体细胞杂交技术为不同遗传背景或克服种间杂交不亲和性提供了可能。体细胞杂交一般通过原生质体融合实现。目前，已有从不同猕猴桃基因型和物种的愈伤组织、悬浮培养液、叶片叶肉和子叶获得原生质体的报道［31-33］。如Xiao和Han［31］成功获得中华猕猴桃和美味猕猴桃的原生质体；Zhang等［32］从体外培养毛花猕猴桃幼苗的新生叶片上分离获得了原生质体；Xiao等［33］报道了分别从中华猕猴桃愈伤组织子叶和狗枣猕猴桃叶肉细胞获得原生质体的结果。

1.2.1.3 其他培养技术：其他组织培养技术主要包括胚挽救、胚乳培养、体外染色体加倍等［34-37］。例如，Mu等［38］利用胚挽救技术成功将二倍体中华猕猴桃和四倍体黑蕊猕猴桃杂交后代胚转移到体外培养。Hirsch等［36］进行了不同猕猴桃种和倍性的杂交（包括狗枣猕猴桃（A.lolomikta）×中华猕猴桃、葛枣猕猴桃×对萼猕猴桃（A.valvata）、软枣猕猴桃×葛枣猕猴桃、狗枣猕猴桃×美味猕猴桃），利用胚挽救技术获得了这些杂交组合的植株苗。陈绪中等［34］利用胚珠培养技术成功获得中华猕猴桃×狗枣猕猴桃种间杂交的杂交后代植株苗。Mu等［35］利用胚培养技术从种间杂交（中华猕猴桃×黑蕊猕猴桃（A.melanandra）、软枣猕猴桃×黑蕊猕猴桃、软枣猕猴桃×美味猕猴桃）F1和F2代种子胚成功的诱导形成了愈伤组织。低温保存技术是一种可以长期保存种质资源的技术在猕猴桃中也有报道［39-42］。如徐小彪等［39］将预先经过MS培养基（包括5% 二甲亚砜和5% 蔗糖）培养4 d、然后通过PVP2溶液（30% 甘油、15% 二甲亚砜、15% PEG和13.7% 蔗糖）在0℃脱水40 min的茎尖（该茎尖从一株矮小中华猕猴桃基因型体外培养获得）转移到液氮中保存，除霜后成活率达到了56.7%。

1.2.2 遗传转化和再生体系 自Matsuta等［43］首次报道了转基因猕猴桃植株以来，已有许多不同异源基因被转化到猕猴桃的研究结果发表。这些基因主要包括：大豆β-1，3内切葡聚糖酶基因［44］、水稻OSH1同源框基因［45］、葡萄氏合成酶基因［46］、调节猕猴桃叶黄素和β-胡萝卜素含量的香叶基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、β-胡萝卜素脱氢酶［47］、提高猕猴桃抗病性和抗旱性的拟南芥Na+/H+逆向转运基因［48］。目前，应用于猕猴桃基因转化的方法较多，以农杆菌介导法和基因枪法为主。

1.2.2.1 农杆菌介导法 该方法有利于转基因低拷贝数目整合到植物基因组。目前已有几个猕猴桃种遗传转化体系被报道，包括中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃、毛花猕猴桃、葛枣猕猴桃和狗枣猕猴桃，这些转化体系主要用的植物外植体组织包括叶片、茎、叶柄、根、子叶下轴和原生质体［49-52］。用于农杆菌转化体系的菌株主要包括农杆菌LBA4404、A281、C58、EHA101和EHA105。目前利用农杆菌介导法发表的几个猕猴桃种转化体系，见表1。

表1 基于不同猕猴桃种建立的遗传转化体系

1.2.2.2 基因枪法 该方法是一种将外源DNA包被在金粉或钨粉微粒表面，在高压作用下轰击受体细胞或组织而达到稳定转化的方法［16］。Qiu等［62］报道了利用基因枪法成功将CaMV 35S转录DHN1基因导入到美味猕猴桃悬浮细胞中。在猕猴桃遗传转化中，也有利用PEG介导法的成功报道，朱道圩等［63］成功的利用该方法将绿色荧光蛋白基因（GFP）转入到了软枣猕猴桃原生质体中。成功获得转基因植株的一个基本条件是选择的植物细胞类型或者外植体可区分整个植株。研究表明，幼叶、叶柄和茎尖组织已被成功用于猕猴桃转化中。一般情况下选择的外植体越幼嫩更容易获得再生植株，而Han等［51］在软枣猕猴桃研究中发现，如果选择太幼嫩的外植体，农杆菌共培养后会出现坏死和褐变现象。因此，有研究者提出要保持猕猴桃外植体在农杆菌共培养条件下的活性和耐性，每3-4周进行体外继代培养必不可少［60］。MS基础培养基也被成功的用于猕猴桃愈伤组织诱导和植株再生［28］。植物生长激素和细胞分裂素的使用主要取决于外植体材料。例如，Fraser等［54］研究发现在中华猕猴桃组织再生中，加入0.1 mg/L的噻苯隆（TDZ）和10 mg/L的激动素再生效果要明显优于其他细胞分裂素。Wang等［60］研究发现在加入了2 mg/L玉米素和3 mg/L的BAP培养基中，可以获得更高的毛花猕猴桃再生芽。Kim等［47］利用包含0.001 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L玉米素的1/2MS培养基获得了美味猕猴桃再生芽。

2 猕猴桃育种进展及其方法

2.1 猕猴桃育种主要进展

据统计，截止到2013年，全球猕猴桃面积约为17万hm2，产量242.80万t（数据引自第八届国际猕猴桃会议资料）。从1978-2013年，我国猕猴桃种植面积从不足1 hm2增加到了11万hm2，截止到2013年我国猕猴桃年产量达到约123.63万t。这些数据说明由于育种家的多年努力，猕猴桃主产国的栽培面积和产量在继续提高。我国猕猴桃育种取得的新进展主要表现在2个方面：（1）主栽区育成一批优良的新品种，实现了国外品种长期主导我国猕猴桃产业的局面。根据相关文献统计，主要美味猕猴桃品种有（陕西）秦美、（湖南）米良1号、（湖北）金魁、（江苏）徐香、（贵州）贵长、（陕西）翠香、（河南）华美2号、（陕西）金香、金硕（湖北）、（湖北）鄂猕猴桃4号、（河南）中猕1号、（安徽）皖翠、（陕西）秦翠、（四川）川猕1号、川猕2号、（河南）蜜宝1号。主要中华猕猴桃品种有（湖北）金桃、（四川）红阳、（陕西）华优、（湖北）金艳、（湖南）翠玉、（湖南）丰悦、（江西）早鲜、（江西）魁蜜、（江西）金丰、（湖南）楚红、（湖北）武植3号、（四川）金什1号、（湖北）金怡、（湖北）鄂猕猴桃3号、（湖北）金早、（湖北）鄂猕猴桃3号、（湖北）金阳1号、金农1号及（四川）川猕3号和川猕4号。主要雄性授粉品种有（新西兰）汤姆利、（新西兰）马图阿、（湖北）磨山4号及（湖北）超红。其他种猕猴桃品种有：毛花猕猴桃品种‘华特’、软枣猕猴桃新品种‘宝贝星’（四川）、黑蕊猕猴桃新品种‘红宝石星’（河南）和大籽猕猴桃新品种‘金铃’（湖北）。在我国大面积栽培的国外品种有海沃德（新西兰）、布鲁诺（新西兰）、Hort16A（新西兰）［1，64，65］。自1978年以来我国选育出了近100多个猕猴桃优良品种（品系），实际上大面积推广栽培的品种很少。截止到2011年，栽培面积占到全国5%的品种仅有红阳、徐香、秦美和金魁4个［1］。总体来说，大面积推广栽培的品种主要表现是产量和品质较高，而最突出的特点是生态适应性广。（2）育种目标趋于多元化发展。例如，传统的猕猴桃以绿肉果实为主，近年来黄肉和红肉猕猴桃逐渐受到消费者青睐，用中华猕猴桃和毛花猕猴桃杂交育成的黄肉品种‘金艳’已经成功进入欧洲和南美市场；另外，也培育了供观赏的品种，如‘江山娇’和‘满天星’［66］。

猕猴桃育种中还存在许多较为突出的问题。总体上可以概括为：育种单位多，组织形式不合理，缺乏有效协作和必要的合作，材料和信息交流不畅通，严重影响了我国猕猴桃大品种和产业的发展水平。具体表现在以下几个方面：一是育种方法和品种单一。目前我国育成的这100多个新品种（系）中，约有95%以上的品种是通过野生、实生选优方法育成的；另外，这些品种中基本上以美味猕猴桃和中华猕猴桃为主，涉及到其他猕猴桃种的很少。二是生物技术应用慢，针对特定性状的分子标记很少，分子标记的开发与猕猴桃育种目标结合不紧密，尚未建立起为育种服务的生物技术平台，标记辅助选择育种技术没有真正在新品种培育中发挥作用。三是新品种审定应进一步规范化。近30多年来全国共育成审定品种数量很多，但大多数品种基本上都是处于“昙花一现”的困窘，真正能够在生产上推广栽培的品种寥寥无几；另外，这些审定的品种中对抗病性（特别是抗溃疡病）等基本上都缺乏鉴定结果，直接影响了品种的推广寿命。

2.2 育种方法和育种路线浅析

现有的猕猴桃育种方法主要有：野生选优、实生选优、芽变选种、杂交育种和渐渗育种等［1］。现阶段，我国猕猴桃育种仍然以野生选优和实生选优为主，利用这些方法培育出的品种为推动猕猴桃产业发展作出了巨大的贡献，如秦美、金魁和金桃等；通过实生选优培育的品种有海沃德、红阳、徐香和华优等；也有经过种间杂交育成的品种，如金艳［64］。野生和实生选优存在育种周期长，同时是建立在大量野生资源收集基础上的。因此，如何将野生和实生选优与分子生物学技术结合起来，加速育种进程和定向性是急需解决的一个问题。另外，种间杂交在猕猴桃育种中应用也较多，该方法可以将感兴趣的野生物种农艺性状通过杂交转育到栽培品种中［67，68］。目前已有许多猕猴桃实现了种间杂交育种，主要包括中华猕猴桃、软枣猕猴桃、黑蕊猕猴桃、大籽猕猴桃（A.macrosperma）和狗枣猕猴桃等［36，38，67-75］。某些物种杂交后代虽然由于受精障碍无法获得可育种子，但在猕猴桃种间杂交中已成功获得了一些优良性状，如实现了红色和黄色果肉、高含量VC、绿色和无毛果皮、高含量的可溶性固形物、花结构和颜色［67，68，70，71］。例如，Hirsch等［36］配置了4个种间杂交组合：狗枣猕猴桃×中华猕猴桃、葛枣猕猴桃×对萼猕猴桃、软枣猕猴桃×葛枣猕猴桃、狗枣猕猴桃×美味猕猴桃，流式细胞分析检测结果表明在这些物种间存在广泛的种间可杂交性。近年来，利用体外染色体加倍技术进行育种的研究也有报道。如Wu等［37］利用秋水仙素离体加倍中华猕猴桃染色体进行育种，这是首次成功的将秋水仙素用于猕猴桃多倍体诱导育种研究中，结果表明加倍效率主要受体外培养基和秋水仙素浓度的相互作用。Wu等［76］报道了自然四倍体和人工诱导四倍体中华猕猴桃染色体减数分裂中的配对行为，指出二倍体种质资源可用于四倍体猕猴桃育种中。也有利用其他方法培育新品种的报道，如Mavromatis等［19］从猕猴桃品种“海沃德”中利用系统的孢子体选择方法选育出了一个新品种。

合理科学的育种理论和方法对指导猕猴桃育种工作具有重要的意义。基于现阶段相关研究进展，我国猕猴桃的育种方法可以分为：传统育种和现代育种。（1）传统育种即选择具有特定性状的杂交亲本进行人工杂交育种以培育具有某种新性状的优良品种或者经过野生选优和实生选优培育新品种，如Atkinson等［77］对毛花猕猴桃利于剥皮的这一特性进行了分析，并将其用于常规杂交育种实践中；（2）现代育种，也可称为快速育种技术，主要是利用现代生物技术进行标记辅助选择育种，并借助生物统计学进行亲本、后代的有效选择和评价基因型和环境相互作用的影响，如黄宏文［1］提出的猕猴桃基因渐渗育种就是现代育种技术的一个范例。如在自然资源不具优势的新西兰和意大利等猕猴桃主产国，其新品种选育大多采用了大量的人工杂交设计育种程序和分子标记辅助选择育种［1］。例如，Gill等［8］利用RAPD分子标记开发了用于猕猴桃性别决定鉴定的序列特异性扩增区（Sequence-characterized amplified region，SCAR）标记，这些标记可以用于猕猴桃标记辅助育种选择中，如对杂交后代在苗期剔除雄株，当作为授粉树时用于选择雄株，或者用于确定种植群体的一个合理的雌雄子代比率。

从育种路线上可以分为：抗逆育种、品质育种和砧木选择育种等。（1）抗逆育种具体包括抗病、抗旱、抗寒和抗热等育种；（2）品质育种主要包括果实大小和形状、果面毛被、果肉颜色、果实质地、果实风味和营养成分等。

基于以上育种方法体系，适应于我国猕猴桃产业发展的育种策略和育种目标可以概括描述为：“以猕猴桃野生种质资源收集和评价为中心，通过传统育种和现代分子生物学技术相结合的方法，培育满足消费者和市场需求的具有新性状的优良品种为目标”。 在具体育种实践中可考虑利用的现代技术包括：染色体重组调控、细胞选择、原生质体融合、倍性操作和胚胎培养等（www.plantandfood.co.nz）。此外，新一代测序技术如转录组测序和SLAF-seq技术对分子生物学的研究发挥了巨大的作用，我国猕猴桃野生资源丰富，利用新一代测序技术进行各种优异资源开发，建立大规模的基因组数据库，可加速育种进程，为培育转基因新品种提供丰富的基因资源［78，79］。

3 展望

猕猴桃因其富含丰富的营养，已成为人们青睐的水果。而优质的猕猴桃新品种是实现其高品质的保证。因此，针对重要性状的多目标育种应是今后相当长时期内猕猴桃产业发展亟需解决的重要任务。

3.1 加强我国野生猕猴桃种质资源的收集、鉴定、评价和利用

野生种质资源中包含着丰富的优异基因，是一个巨大的天然“基因库”，也是新品种选育的主要材料来源。目前主栽的猕猴桃品种基本上都是利用野生资源选育的，如海沃德和秦美。猕猴桃野生种质资源可以考虑从以下几个方面着手开展工作：一是加强野外资源调查工作。野生种质资源调查应是育种工作者坚持的一项常规性工作，当前更多的青年研究者热衷于从事实验室和分子研究工作，而往往忽视了野生资源的收集与利用；二是加强开展野生资源多目标评价筛选和优异基因的发掘。对野生资源的利用不能仅仅局限于品种选育方面，如在以往的抗逆性资源筛选和转基因研究中，选择的研究材料多集中在栽培品种中，将抗逆资源筛选和抗逆基因发掘的重点放在野生植物上更为可行，因为这方面的抗逆资源更为丰富、抗性更强，而且与栽培品种相比，这类野生植株存活需求是第一位的，产量品质是第二位的，生态生理效益在先，只要生存下来，就有机会实现其栽培经济目标。具体来说，在猕猴桃研究中，可从野生资源中鉴定筛选抗旱、抗寒砧木，利用抗猕猴桃溃疡病材料进行抗性基因发掘，为培育转基因品种奠定夯实的材料基础。

3.2 加强猕猴桃特异资源的种质创新

通过植物基因工程、种间杂交、胚挽救和花药培养等方法可以实现新种质创新。特别是以猕猴桃野生近缘种为供体，与栽培品种杂交，同时利用“高代回交法”，可以将近缘种中的优异目标基因快速转移到栽培种中。目前，猕猴桃分子研究的目标性状多集中在果实风味、香味、成熟和颜色上；另外，由于溃疡病的大面积爆发，近年来在猕猴桃溃疡病方面的研究也越来越多，而对抗逆性状的研究相对较少。另外，猕猴桃雄性授粉品种特异资源的培育也是一个研究重点，利用野生资源进行雄性品种选育需要注意几个问题：一是选择树体健壮，花量大，花母枝开花数量多，每朵花含有的花粉粒多，花粉发芽率高，花期长的资源；二是选择多种倍性的雄株，以保证与雌性品种的配套，并开展多种雄花与栽培品种的花粉直感效应研究，为生产上栽培品种提供最优的配套雄株；三是在筛选猕猴桃主栽品种专用授粉雄株的基础上，开发花粉加工专用设备组装形成生产线，建设花粉生产工厂。如本单位已经研制出了猕猴桃雄株花粉加工专用设备、制定了花粉生产工艺、生产技术标准、辅助授粉器，该项目成果已在生产中进行了广泛的推广应用。

3.3 加强基因组学技术在猕猴桃育种中的应用

生物技术育种取得的系列研究进展，特别是中华猕猴桃‘红阳’基因组测序成果的发表，为实现分子标记辅助选择和不同猕猴桃种质资源有利性状的基因渗入培育新品种奠定了基础，加速了猕猴桃分子育种的进程，给猕猴桃育种提供了新的发展机遇。在猕猴桃基因组学育种实践中，建议可考虑以下几方面工作：（1）功能标记是可用于育种工作的一种理想标记，功能标记的开发是以克隆基因序列、标记与特定性状的关系为前提的，该标记可用于亲本鉴定、育种后代材料的基因检测以及分离世代抗病性和品质性状的选择；（2）利用基因标记开展聚合育种，如聚合抗溃疡病或褐斑病的基因，以增加品种的多抗性和持久性；（3）利用流式细胞仪开展倍性育种，利用不同倍性亲本杂交可以提高结实率，不同杂交组合的杂交亲和性与亲本的基因型有关，特别是母本的基因型，因此在杂交后代进行倍性鉴定开展早期定向选择育种是非常有意义的。

3.4 加强猕猴桃生态学研究

生态学是一个广义的概念，而猕猴桃生态学属于相对狭义的范畴，其可以描述为野生猕猴桃种质资源赖以生存的自然生态环境，以及猕猴桃栽培品种适生的气候和土壤等生态环境因子共同构成的一个综合体。随着猕猴桃品种的多样化发展，对新培育品种的生态适应性提出了更高的要求；另一方面，随着全球气候的变暖，水涝灾害时有发生，加上水肥的使用不合理，进一步阻碍了猕猴桃产业的快速发展。因此，提高猕猴桃果园水肥利用效率，实现在现有面积上通过改变果园微生态环境提高其生物学产量是一个亟需研究解决的新课题。

相比于苹果等大宗果树而言，猕猴桃科学研究起步相对较晚，研究深度也较浅。今后可考虑从以下6个方面全面、系统、科学的加强猕猴桃基础研究：（1）种质资源和分类：如野生猕猴桃资源调查及其在杂交育种中的应用、特异资源的遗传多样性和种群遗传结构、多倍性遗传多样性及在品种保护中的利用；（2）营养和生理：如微量元素等喷施对猕猴桃品质的影响、土壤障碍因子对果树产量的影响、果实软熟期果皮形态特征变化、淀粉累积和糖分代谢特征；（3）遗传和育种：倍性遗传与多倍体育种、远缘杂交育种选育目标性状新品种、修剪方法对果树光合和果实特征的影响；（4）采后生物学：如外源激素（乙烯和臭氧）对猕猴桃果实储藏期及其蛋白质组的影响；（5）抗虫和抗病：如猕猴桃抗溃疡病、根腐病和病虫害控制；（6）生产、管理和市场：春季修剪时间对猕猴桃产量和质量的影响；溃疡病对猕猴桃企业的影响。

［1］ 黄宏文. 猕猴桃属分类资源驯化栽培［M］. 北京：科学出版社，2013.

［2］ Li X， Li J， Doejarto DD. Advances in the study of the systematics of Actinidia Lindley［J］. Frontiers of Biology in China， 2009， 4（1）：55-61.

［3］ Crowhurst RN， Gleave AP， MacRae EA， et al. Analysis of expressed sequence tags from Actinidia：applications of a cross species EST database for gene discovery in the areas of flavor， health， color and ripening［J］. BMC Genomics， 2008， 9：351.

［4］ Zhou J， Liu YF， Huang HW. Characterization of 15 Novel single nucleotide polymorphisms（Snps）in the Actinidia chinensis SPECIES COMplex（Actinidiaceae）［J］. American Journal of Botany， 2011， 98（5）：E100-E102.

［5］ Crowhurst RN， Lints R， Atkinson RG， et al. Restriction fragment length polymorphisms in the genus Actinich’a（Actinidiaceae）［J］. Plant Systemtics and Evolution， 1990， 172：193-203.

［6］ Huang WG， Cipriani G， Morgante M， et al. Microsatellite DNA in Actinidia chinensis：isolation， characterisation， and homology inrelated species［J］. Theoretical and Applied Genetics， 1998， 97（8）：1269-1278.

［7］ Gill GP， Harvey CF， Gardner RC， et al. Development of sex-linked PCR markers for gender identification in Actinidia［J］. Theoretical and Applied Genetics， 1998， 97（3）：439-445.

［8］ Xiao XG， Zhang LS， Li SH， et al. First step in the search for AFLP markers linked to sex in Actinidia［J］. Fourth International Symposium on Kiwifruit， Proceedings， 1999， 498：99-104.

［9］ Testolin R， Huang WG， Lain O， et al. A kiwifruit（Actinidia spp.）linkage map based on microsatellites and integrated with AFLP markers［J］. Theoretical and Applied Genetics， 2001， 103（1）：30-36.

［10］ Huang HW， Li ZZ， Li JQ， et al. Phylogenetic relationships in Actinidia as revealed by RAPD analysis［J］. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2002， 127（5）：759-766.

［11］ Shirkot P， Sharma DR， Mohapatra T. Molecular identification of sex in Actinidia deliciosa var. deliciosa by RAPD markers［J］. Scientia Horticulturae， 2002， 94（1-2）：33-39.

［12］ Fraser LG， Harvey CF， Crowhurst RN， et al. EST-derived microsatellites from Actinidia species and their potential for mapping［J］. Theoretical and Applied Genetics， 2004， 108（6）：1010-1016.

［13］ Korkovelos AE， Mavromatis AG， Huang WG， et al. Effectiveness of SSR molecular markers in evaluating the phylogenetic relationships among eight Actinidia species［J］. Scientia Horticulturae， 2008，116（3）：305-310.

［14］ Novo M， Romo S， Rey M， et al. Identification and sequence characterisation of molecular markers polymorphic between male kiwifruit（Actinidia chinensis var. deliciosa（A. Chev. ）A. Chev.）accessions exhibiting different flowering time［J］. Euphytica，2010， 175（1）：109-121.

［15］ Zhen Y， Li Z， Huang HW， et al. Molecular characterization of kiwifruit（Actinidia）cultivars and selections using SSR markers［J］. Journal of the American Society of Horticultural Science， 2004， 129：374-382.

［16］ 井赵斌， 俞靓， 魏琳， 等. 国外牧草基因组学和转基因技术研究进展［J］. 生物技术通报， 2011（11）：12-25.

［17］ Palombi AM， Damiano C. Comparison between RAPD and SSR molecular markers in detecting variation in kiwifruit（Actinidia deliciosa A. Chev）［J］. Plant Cell Reports， 2002， 20：1061-1066.

［18］ Korkovelos AE， Goulas CK， Vasilakakis MD. Screening microsatellites for their effectiveness to identify and differentiate among Actinidia genotypes［J］. Acta Hort. （ISHS）， 2003， 610：357-363.

［19］ Mavromatis AG， Arvanitoyannis I， Nanos G， et al. Molecular fingerprinting of a new kiwifruit cultivar（cv. Tsehelidis）and comparative analysis with cv. Hayward according to physicochemical properties［J］. Scientia Horticulturae， 2010，125：277-282.

［20］ Fraser LG， Tsang GK， Datson PM， et al. A gene-rich linkage map in the dioecious species Actinidia chinensis（kiwifruit）reveals putative X/Y sex-determining chromosomes［J］. BMC Genomics，2009， 10：102.

［21］ 汤佳乐， 吴寒， 郎彬彬， 等. 野生毛花猕猴桃叶片和果实AsA含量的SSR标记关联分析［J］. 园艺学报， 2014， 41（5）：833-840.

［22］ Richardson AC， Boldingh HL， McAtee PA， et al. Fruit development of the diploid kiwifruit， Actindia chinensis ‘Hort16A’. ［J］BMC Plant Biology， 2011， 11：182.

［23］ Varkonyi-Gasic E， Moss SM， Voogd C， et al. Identification and characterization of flowering genes in kiwifruit：sequence conservation and role in kiwifruit flower development［J］. BMC Plant Biology， 2011， 11：72.

［24］ 黄春辉， 高洁， 曲雪艳， 等. 中华猕猴桃黄肉色泽变化研究与转录组测序［J］. 园艺学报， 2012， 39：2607.

［25］ Huang SX， Ding J， Deng DJ， et al. Deaft genome of the kiwifruit Actinidia chinensis［J］. Nature Communications， 2013， 4：2640.

［26］ Harada H. In vitro organ culture of Actinidia chinensis Pl. as a technique for vegetative multiplication［J］. Journal of Horticultural Science， 1975， 50（1）：81-83.

［27］ Lin QL， Chen ZQ， Wu JS. Propagation in vitro of some excellent clones of kiwifruit［J］. Journal of Fujian Agricultural University，1994， 23（3）：271-274.

［28］ Kumar S， Sharma DR. In vitro propagation of kiwifruit［J］. Journal of Horticultural Science and Biotechnology， 2002， 77（5）：503-508.

［29］ Kim M， Kim SC， Moon DY， et al. Rapid shoot propagation from microcross sections of kiwifruit（Actinidia deliciosa cv.‘Hayward’）［J］. Journal of Plant Biology， 2007， 50（6）：681-686.

［30］ Barbieri C， Morini S. Plant regeneration from Actinidia callus cultures［J］. Journal of Horticultural Science， 1987， 62（1）：107-109.

［31］ Xiao Z， Han B. Interspecific somatic hybrids in Actinidia［J］. Acta Botanica Sinica， 1997， 39（12）：1110-1117.

［32］ Zhang YJ， Qian YQ， Mu XJ， et al. Plant regeneration from in vitrocultured seedling leaf protoplasts of Actinidia eriantha Benth［J］. Plant Cell Reports， 1998， 17（10）：819-821.

［33］ Xiao Z， Wan L， Han B. An interspecific somatic hybrid between Actinidia chinensis and Actinidia kolomikta and its chilling tolerance［J］. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2004， 79（3）：299-306.

［34］ 陈绪中， 李丽， 张忠慧， 等. 猕猴桃种间远缘杂交胚珠培养［J］.果树学报， 2006， 23（4）：620-622.

［35］ Mu SK， Fraser LG， Harvey CF. Initiation of callus and regeneration of plantlets from endosperm of Actinidia interspecific hybrids［J］. Scientia Horticulturae， 1990a， 44（1-2）：107-117.

［36］ Hirsch AM， Testolin R， Brown S， et al. Embryo rescue from interspecific crosses in the genus Actinidia（kiwifruit）［J］. Plant Cell Reports， 2001， 20：508-516.

［37］ Wu JH， Ferguson AR， Murray BG. Manipulation of ploidy for kiwifruit breeding：in vitro chromosome doubling in diploid Actinidia chinensis Planch［J］. Plant Cell Tissue Organ Culture，2011， 106：503-511.

［38］ Mu XJ， Wang WL， Cai DR， et al. Embryology and embryo rescue of an interspecific cross between Actinidia deliciosa cv. Hayward and A. eriantha［J］. Acta Botanica Sinica， 1990b， 32：425-431.

［39］ 徐小彪， 辜青青， 蔡祖国， 等. 玻璃化法超低温保存猕猴桃离体茎尖及其植株再生［J］. 园艺学报， 2006， 33（4）：842-844.

［40］ Bachiri Y， Song GQ， Plessis P， et al. Routine cryopreservation of kiwifruit（Actinidia spp）germplasm by encapsulationdehydration：importance of plant growth regulators［J］. Cryo Letters， 2001， 22（1）：61-74.

［41］ Wu Y， Zhao Y， Engelmann F， et al. Cryopreservation of kiwi shoot tips［J］. Cryo Letters， 2001， 22（5）：277-284.

［42］ Zhai Z， Wu Y， Engelmann F， et al. Genetic stability assessments of plantlets regenerated from cryopreserved in vitro cultured grape and kiwi shoot-tips using RAPD［J］. Cryo Letters， 2003， 24（5）：315-322.

［43］ Matsuta N， Iketani H， Hayashi T. Effect of acetosyringone on kiwifruit transformation［J］. Japan Journal of Breed， 1990， 40：184-185.

［44］ Nakamura Y， Sawada H， Kobayashi S， et al. Expression of soybean beta -1， 3-endoglucanase cDNA and effect on disease tolerance in kiwifruit plants［J］. Plant Cell Reports， 1999， 18（7/8）：527-532.

［45］ Kusaba S， Kano-Murakami Y， Matsuoka M， et al. Expression of the rice homeobox gene， OSH1， causes morphological changes in transgenic kiwifruit［J］. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science， 1999， 68（3）：482-486.

［46］ Kobayashi S， Ding CK， Nakamura Y， et al. Kiwifruits（Actinidia deliciosa）transformed with a Vitis stilbene synthase gene produce piceid（resveratrol-glucoside）［J］. Plant Cell Reports， 2000， 19（9）：904-910.

［47］ Kim M， Kim S， Song K， et al. Transformation of carotenoid biosynthetic genes using a micro-cross section method in kiwifruit（Actinidia deliciosa cv. Hayward）［J］. Plant Cell Reports， 2010，29（12）：1339-1349.

［48］ Tian N， Wang J， Xu ZQ. Overexpression of Na+/H+antiporter gene AtNHX1 from Arabidopsis thaliana improves the salt tolerance of kiwifruit（Actinidia deliciosa）［J］. South African Journal of Botany， 2011， 77（1）：160-169.

［49］ Uematsu C， Murase M， Ichikawa H， et al. Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of kiwifruit［J］. Plant Cell Reports， 1991， 10（6/7）：286-290.

［50］ Famiani F， Ferradini N， Standardi A， et al. In vitro regeneration of different Actinidia species［J］. Acta Horticulturae， 1997， 444：133-138.

［51］ Han M， Gleave AP， Wang T. Efficient transformation of Actinidia arguta by reducing the strength of basal salts in the medium to alleviate callus browning［J］. Plant Biotechnology Reports， 2010，4（2）：129-138.

［52］ Wang T， Atkinson R， Janssen B. The choice of Agrobacterium strain for transformation of kiwifruit［J］. Acta Horticulturae，2007， 753（1）：227-232.

［53］ HortResearch. Kiwifruit Genomics Programme. HortResearch，Auckland， 2005.

［54］ Fraser LG， Kent J， Harvey CF. Transformation studies of Actinidia chinensis Planch［J］. New Zealand Journal of Crop Horticulture Science， 1995， 23：407-413.

［55］ Wang T， Atkinson R， Janssen B. The choice of Agrobacterium strain for transformation of kiwifruit［J］. Acta Horticulturae， 2007， 753（1）：227-232.

［56］ Oliveira MM， Barroso J， Pais MS. Direct gene transfer into Actinidia deliciosa protoplasts：analysis of transient expression of the CAT gene using TLC autoradiography and a GC-MS based method［J］. Plant Molecular Biology， 1991， 17：235-242.

［57］ Janssen BJ， Gardner RC. The use of transient GUS expression to develop an Agrobacterium-mediated gene-transfer system for kiwifruit［J］. Plant Cell Reports， 1993， 13：28-31.

［58］ Yazawa M， Suginuma C， Ichikawa K， et al. Regeneration of transgenic plants fromhairy root of kiwi fruit（Actinidia deliciosa）induced by Agrobacterium rhizogenes［J］. Breed Science， 1995，45：241-244.

［59］ Yamakawa Y， Chen LH. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of kiwifruit（Actinidia deliciosa）by direct formation of adventitious buds［J］. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science， 1996， 64：741-747.

［60］Wang T， Ran Y， Atkinson RG， et al. Transformation of Actinidia eriantha：A potential species for functional genomics studies in Actinidia［J］. Plant Cell Reports， 2006， 25：425-431.

［61］Firsov AP， Dolgov SV. Agrobacterial transformation of Actinidia kolomicta［J］. Acta Horticulturae， 1997， 447：323-328.

［62］Qiu Q， Wang Z， Cai Q， et al. Changes of DHN1 expression and subcellular distribution in A. delicisoa cells under osmotic stress［J］. Science in China Series C-Life Sciences， 2002， 45（1）：1-9.

［63］朱道圩， 米银法， 陈延惠， 等. GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究［J］. 河南农业大学学报，2003， 37（2）：145-148.

［64］黄宏文. 中国猕猴桃种质资源［M］. 北京：中国林业出版社，2013.

［65］Huang HW. The Genus ACTINIDIA：A World Monograph［M］. Beijing：Science Press， 2014.

［66］Wang S， Jiang Z， Huang H， et al. Conservation and utilization of germplasm resources of the genus Actinidia［J］. Acta Horticulturae， 2003， 610：365-371.

［67］Beatson RA， Datson PM， Harris-Virgin PM， et al. Progress in the breeding of novel interspecific Actinidia hybrids［J］. Acta Horticulturae， 2007， 753：147-153.

［68］Cho HS， Jo YS， Liu IS， et al. Characteristics of Actinidia deliciosa×A. arguta and A. arguta ×A. deliciosa hybrids［J］. Acta Horticulturae， 2007， 753：205-210.

［69］王圣梅， 黄仁煌， 武显维， 等. 猕猴桃远缘杂交育种研究［J］.果树学报， 1994， 11（1）：23-26.

［70］安和祥， 蔡达荣， 母锡金， 等. 猕猴桃种间杂交的新种质［J］.园艺学报， 1995， 22（2）：133-137.

［71］范培格， 安和祥， 蔡达荣， 等. 美味猕猴桃海沃德与毛花猕猴桃种间杂交及优株的选育［J］. 果树学报， 2004. 21（3）：208-211.

［72］Ke SQ， Huang RH， Wang SM， et al. Studies on interspecific hybrids of Actinidia［J］. Acta Horticulturae， 1991， 297：133-139.

［73］Liang TB， Mu XJ. Observation of pollen tube behaviour and early embryogenesis following interspecies pollination between Actinidia deliciosa and A. arguta［J］. Acta Botanica Sinica， 1995， 37：607-612.

［74］Guthrie RS， Luby JJ， Bedford DS， et al. Partial dominance in Actinidia kolomikta interspecific hybrids［J］. Acta Horticulturae，2007， 753：211-218.

［75］Mizugami T， Kim JG， Beppu K， et al. Observation of parthenocarpy in Actinidia arguta selection ‘Issai’［J］. Acta Horticulturae，2007， 753：199-204.

［76］Wu JH. Datson PM. Manako KI， et al. Meiotic chromosome pairing behaviour of natural tetraploids and induced autotetraploids of Actinidia chinensis［J］. Theoretical and Applied Genetics， 2014，127（3）：549-557.

［77］Atkinson RG， Sharma NN， Hallett IC， et al. Actinidia eriantha：a parental species for breeding kiwifruit with novel peelability and health attributes［J］. New Zealand Journal of Forestry Science，2009， 39：207-216.

［78］井赵斌， 魏琳， 俞靓， 等. 转录组测序及其在牧草基因资源发掘中的应用前景［J］. 草业科学， 2011b， 28（7）：1364-1369.

［79］Sun X， Liu D， Zhang X， et al. SLAF-seq：an efficient method of large-scale de novo SNP discovery and genotyping using highthroughput sequencing［J］. PLoS One， 2013， 8（3）：e58700.

（责任编辑 狄艳红）

Biotechnology and Kiwifruit Breeding in China

Jing Zhaobin1，2Lei Yushan1，2，3Li Yongwu2，3
（1. Shaanxi Rural Science and Technology Development Center，Xi’an 710054；2. Xi’an Kiwifruit Experiment Station of Shaanxi Province，Xi’an 710054；3.Hanzhong Kiwifruit Research Institute of Shaanxi Province，Hanzhong 723500）

Kiwifruit（Actinidia Lindl.）is an important fruit tree crop in China. With the development of modern biotechnology，traditional breeding of kiwifruit is mainly based on the selection from wilding and seedling，these methods presents coexist situation the challenge and opportunity compared with the application of molecular breeding such as the genomics and transgenesis. Compared with the other fruit trees，the researches for the genomics of kiwifruit are still at a relatively low level. This paper summarized the method，application，and the latest research progress of modern biotechnology in kiwifruit genetic breeding，and discussed the breeding strategy of kiwifruit in China，in order to provide the method and thought reference for kiwifruit conversional and transgenesis breeding in China.

Actinidia；genome； transgene； breeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.036

2015-01-21

国家科技支撑计划课题（2014BAD16B05-3），国家国际合作专项项目（S2015ZR1042），陕西省科技统筹创新工程计划项目（2012KTJD03-01），陕西省自然科学基础研究计划项目（2014JM3077），陕西省科技统筹创新工程计划工程（2015KTZDNY02-03-01）

井赵斌，男，博士，研究方向：猕猴桃育种与生理生态；E-mail：zxxjzb520@gmail.com

雷玉山，男，硕士，研究方向：猕猴桃育种；E-mail：leiyush@163.com