中华绒螯蟹性腺特异表达蛋白EsSOX21b-like的原核表达与抗体制备

杨国翠 崔峥 邱高峰

（上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）

中华绒螯蟹性腺特异表达蛋白EsSOX21b-like的原核表达与抗体制备

杨国翠 崔峥 邱高峰

（上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）

Sox（SRY-related HMG-box）基因编码一类重要的转录因子，其产物都具有一个HMG基序保守区。之前我们在中华绒螯蟹分离鉴定了一个只在性腺中特异表达转录本EsSox21b-like，为了验证EsSOX21b-like蛋白是否也在中华绒螯蟹性腺中特异表达，本研究原核表达了EsSOX21b-like蛋白，即将EsSox21b-like基因序列克隆到pGEX-2T表达载体，构建重组表达质粒pGEX-2T-EsSox21b-like，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导融合表达，经SDS-PAGE分析表明，融合蛋白主要以包涵体形式存在，分子量约为54 kD。利用Ni柱亲和纯化融合蛋白后免疫家兔，制备了多克隆抗体，Western blotting检测表明该抗体能特异地识别性腺组织中EsSOX21b-like蛋白，而在其他组织未检测到其表达，目的蛋白分子量约为28 kD，在精巢组织中的表达量比在卵巢中高，该结果暗示EsSOX21b-like可能在性腺发育过程中起重要调控作用。

中华绒螯蟹；EsSOX21b-like蛋白；原核表达；抗体制备

Sox（SRY-related HMG-box）基因是一类SRY（sex-determining region of Y chromosome）相关基因，编码一系列转录因子，参与性别决定与分化、骨组织发育、血细胞生成、神经系统发育、晶状体发育等多种早期胚胎发育过程［1］。SRY基因是哺乳动物雄性性别决定基因，对睾丸的发育有着决定性的影响，它首先在人类Y染色体上发现，是Sox基因家族的第一个成员［2］。其产物含有一个HMG盒［3］，能够与DNA特异性结合，调控其转录。之后研究发现了许多与SRY相关的Sox基因，Sox3、Sox5、Sox6、Sox8、Sox9、Sox17等都是参与性别分化的重要基因。Sox9基因雄鼠胚胎精巢中表达，具有促使精巢支持细胞分化的作用［4；5］。在小鼠中Sox9基因的缺失导致XY向XX的性反转现象［6］。Sox3是与SRY同源性最高的基因［7］，但是并不直接参与睾丸的分化和发育，Graves［7］认为在雌性中，Sox3表达，抑制了Sox9的表达；在雄性中SRY抑制Sox3，Sox9得以表达，从而决定睾丸的形成。Sox8也是哺乳动物睾丸决定途径相关的基因，能够促进Sox9在睾丸形成中的作用。但是，Sox8基因缺陷的小鼠睾丸发育正常［8］。另外，Sox5、Sox6在小鼠的减数分裂后的生殖细胞中表达，尤其是在精细胞阶段［9］；Sox17则在减数分裂前的精母细胞中表达［10］。

水产动物中也发现存在Sox基因，参与性别决定与分化过程。虹鳟中Sox24作为转录因子在卵子发生过程起作用［11］。黄鳝Sox17在精巢、卵巢和两性腺中表达，特别是在卵巢、两性腺和精巢片层及生精细胞中含量更高，可以推测Sox17对黄鳝自然性反转过程中的性腺发育有重要作用［12］。鲈鱼在150 d性别分化开始时Sox17在雌雄性腺中均表达，在250 d能观察到明显的性别差异时，雌鱼Sox17表达量明显高于雄鱼，并且其RNA水平与芳香化酶相关，可能参与卵巢发育［13］。另外鲈鱼中还发现存在Sox19与卵巢分化相关［14］。但是在甲壳类动物中Sox基因是否参与性别决定与分化过程目前尚不清楚。

本研究组之前在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）克隆得到只在性腺中特异表达转录本EsSox21blike［15］，并在RNA水平分析了Sox基因的组织表达，结果显示EsSox21b-like基因在精巢、卵巢中均有表达，推测EsSox21b-like可能参与性腺的发育。为验证EsSox21b-like基因在蛋白水平的表达及作用，本研究组构建了EsSOX21b-like蛋白原核表达质粒，并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白，纯化重组蛋白，制备EsSOX21b-like多克隆抗体，并对抗体进行免疫学鉴定，旨为进一步研究中华绒螯蟹性别决定与分化机制提供强有力的工具。

1 材料与方法

1.1 材料

中华绒螯蟹购自当地水产市场。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）感受态细胞、原核表达载体pGEX-2T为本实验室保存，Trizol购自Invitrogen。First strand cDNA synthesis kit，Ex-Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自TaKaRa。BamHⅠ和EcoRⅠ购自Promega。PCR纯化产物试剂盒、低分子蛋白Marker、预染蛋白Marker、SDSPAGE各组分购自上海天根生化科技公司。His-select Spin Columns纯化试剂盒、His标签抗体购自Sigma。辣根过氧化物标记的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG购自艾比玛特。DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原核表达载体的构建 使用Trizol Reagent提取中华绒螯蟹性腺总RNA，经DNaseⅠ处理后，按First strand cDNA synthesis kit说明书进行反转录，获得的cDNA作为模板，扩增EsSox21b-like基因。根据本实验室已克隆到的中华绒螯蟹EsSox-like基因全长cDNA序列，利用Primer 5软件设计特异引物（表1），扩增EsSox-like编码区序列。同时，该对引物的5'端分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，另外，在下游引物紧邻终止密码子的3'端引入编码6个组氨酸核酸序列。反应条件为：94℃预变性3 min，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1.5 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用柱纯化回收与pGEX-2T分别进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切（37℃，2 h），酶切产物纯化，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，扩大培养阳性克隆提取质粒（天根质粒抽提试剂盒），经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定和测序（上海美吉生物），确定插入片段序列正确性。

1.2.2 工程菌的诱导表达 重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。挑选阳性菌落接种于液体培养基中，37℃，振荡培养过夜。次日按1∶100的比例在含有Amp+（终浓度为60 μg/mL）的液体培养基中扩大培养至OD595介于0.4-0.6之间，加IPTG诱导表达。离心收集菌体（5 000 r/min，5 min 4℃），用1×PBS重悬菌体，冰浴下超声波破碎（超声时间4 s，间歇时间4 s，保护温度24℃，总时间90次）。12 000 r/min 4℃离心10 min，沉淀用含8 mol/L尿素的1×PBS重悬，分别取等量的上清和重悬液SDS-PAGE（5%浓缩胶，12%分离胶）电泳，考马斯亮蓝R250染色过夜，充分脱色后观察并分析结果。

表1 构建EsSox21b-like原核表达载体使用的PCR特异引物

1.2.3 Western blotting检测融合蛋白 重组蛋白经SDS-PAGE分析后，使用半干转移膜将重组蛋白转移到硝酸纤维NC膜上。含10%小牛血清的TTBS室温封闭1 h，1∶1 000稀释的His标签单抗为一抗4℃孵育过夜，TTBS洗涤3次，1∶3 000稀释的HRP标记山羊抗兔的IgG为二抗，室温孵育2 h，TTBS缓冲液洗涤3次，去除非特异性结合，用DAB显色液（DAB 15 mg、甲醇 5 mL、30%双氧水15 μL）显色。

1.2.4 EsSOX21b-like多克隆抗体的制备及检测 用His-select Spin Columns纯化试剂盒纯化的重组蛋白经弗氏佐剂乳化后免疫2只成年健康的大白兔。初次免疫后，每隔2周加强免疫1次，第5次免疫后8 d处死兔子。取全血分离血清，抗原亲和纯化血清。1.2.5 组织蛋白的提取以及抗血清的检测 分别取50 mg精巢、卵巢、心脏、肝胰腺、肌肉、胸神经节和鳃组织与2 mL离心管中，加入1 mL组织蛋白抽提液（博士德），于冰上充分匀浆后4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清。SDS-PAGE电泳，转膜，适度稀释的EsSOX21b-like多克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗进行Western检测。

2 结果

2.1 原核表达载体的构建

以中华绒螯蟹性腺cDNA为模板，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳得到一条约800 bp的条带，与目的片段大小基本一致。将其克隆至原核表达载体pGEX-2T中，得到重组质粒。BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒，琼脂糖凝胶电泳（图1）显示在800 bp处有条带。同时测序结果也显示，克隆得到的序列与EsSox21b-like ORF一致，并且在其终止密码子前成功的引入了编码6个组氨酸的核酸密码子序列。将重组质粒命名为pGEX-2T-EsSox21b-like。

图1 重组质粒pGEX-EsSox21b-like双酶切图

2.2 重组蛋白的表达及检测

重组质粒pGEX-2T-EsSox21b-like转化大肠杆菌BL21（DE3）。IPTG诱导，超声破碎，离心分离沉淀与上清，SDS-PAGE电泳分析。与未经IPTG诱导的工程菌相比，诱导组的沉淀中有一条明显加粗的条带（图2，箭头），分子量约54 kD，这与EsSox21b-like基因编码的蛋白分子量（28 kD）和pGEX-2T上携带的GST标签蛋白（图2，箭头）分子量（26.3 kD）总和相当。在分离的上清中则未检出相应的条带。

为了证实重组蛋白的表达，使用His标签抗体做为一抗进行Western blotting分析，免疫检测发现在54 kD处有特异性条带（图3）。说明经过诱导后能成功的获得融合蛋白，且该融合蛋白主要以包涵体的形式存在。

图2 pGEX-2T-EsSox21b-like融合蛋白表达产物的SDSPAGE检测

图3 His抗体检测EsSOX21b-like重组蛋白的Western blotting分析

2.3 EsSOX21b-like抗体的制备与免疫鉴定

纯化后的重组蛋白分5次注射免疫2只家兔，制备EsSO21b-like多克隆抗体。第5次免疫后采血，抗血清用包被有重组EsSOX21b-like蛋白的酶标板进行间接ELISA反应，每孔用100 μL浓度为1 μg/mL的抗原包被，用酶标仪读取450 nm下的光吸收值，吸光度（OD值），结果（表2）显示2只兔在第5次免疫后，其血清分别在1∶8 000和1∶16 000的稀释度下，OD值大于1.000，说明制备的多抗效价高。

使用制备的EsSOX21b-like多抗检测EsSOX21blike蛋白的组织分布情况。Western blotting结果（图4）显示中华绒螯蟹精巢、卵巢的蛋白提取物中能够检测到特异性条带，且该特异性条带所对应的蛋白分子量与软件预测的EsSOX21b-like蛋白分子量（28 kD）大小相等。而心脏、肝胰腺、肌肉、胸神经节和鳃组织总蛋白中则不能检测到特异性条带。该结果说明制备的EsSOX21b-like多克隆抗体能有效的与目的蛋白结合，EsSOX21b-like蛋白在性腺组织中特异表达，并且在精巢组织中表达量高于卵巢。

图4 EsSOX21b-like 抗体检测不同组织总蛋白

表2 ELISA法检测抗体效价

3 讨论

本研究通过IPTG诱导、超声波破碎工程菌，在沉淀中检测到融合表达的目的蛋白，并且用Hisselect Spin Columns纯化获得的融合蛋白能够有效地免疫家兔获得效价高、特异性强的EsSOX21b-like蛋白的多克隆抗体。相反，在离心后的上清液中没有检测到可溶性的融合蛋白，说明表达的蛋白以包涵体形式存在。与具有活性的可溶性蛋白相比包涵体蛋白具有相同的一级结构，不影响抗体制备，只是由于肽链无法正确折叠形成二、三级结构而不具有生物活性［16］。包涵体蛋白经过变性、洗涤、复性、纯化等一系列处理过程最终可以转变为活性蛋白［17］。之前许多研究表明，原核表达也可以获得有活性的可溶蛋白［18-21］，其中IPTG的诱导至关重要，可以通过减少IPTG的诱导量和诱导时间控制目的蛋白表达量，避免包涵体的形成；温度对蛋白的可溶性也有很大的影响，如范丙友［21］通过降低温度等成功获得了可溶性的香豆酸：辅酶A连接酶。除此之外，以大肠杆菌为宿主细胞进行原核表达时，还可以在培养基中加入一些能促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，如高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖（阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应）、乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子质量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaC1等来增加融合蛋白的溶解度［22］。后续我们拟采用以上各种实验方法进行直接诱导表达以其获得具有活性的目的蛋白，为研究EsSOX21b-like 蛋白生物学功能奠定必不可少的物质基础。

Sox21基因是SoxB基因亚族中的重要一员，在脊椎动物与无脊椎动物中均有发现。在小鼠，Sox21在未成熟神经系统脑室区表达，而在成熟脑内其表达则限制在脑室下区，进一步的研究证实Sox21在小鼠神经系统发育过程能抑制神经元分化［23］。另外，Sox21在小鼠的耳蜗中也有表达，且Sox21缺陷型小鼠表现出轻度听力障碍［24］。在斑马鱼，Sox21存在Sox21a与Sox21b两种亚型，Sox21a在脑、皮肤、肠及卵巢中表达，而Sox21b除了影响性腺的正常发育外对晶状体的正常发育也会起到一定的调控作用［25，26］。Sox21b基因在蜂王卵巢管中的滋养细胞及其卵子中也有较强表达，在蜜蜂卵巢发育及成熟过程中发挥其功能［27］。蜜蜂在分类系统上与中华绒螯蟹同属于节肢动物门，其亲缘关系更加紧密，故彼此相同的基因在表达特征与功能上应该相近或相同。之前我们的研究结果表明，中华绒螯蟹EsSox21blike基因的mRNA仅局限在精巢和卵巢表达，暗示在精子的发生及卵细胞的发育过程中发挥作用。本研究在蛋白水平进一步证明EsSOX21b-like在性腺中特异表达，且在精巢组织中表达量明显高于卵巢，推测该蛋白可能是精巢发育必不可少的因子。

4 结论

本研究以中华绒螯蟹性腺为模板，设计特异性引物，扩增EsSox21b-like的开放阅读框，克隆至pGEX-2T表达载体，在大肠杆菌中表达EsSOX21blike重组蛋白。SDS-PAGE结果显示，EsSOX21b-like重组蛋白主要以包涵体形式存在。大量表达重组蛋白，亲和层析纯化后免疫家兔，得到高效价的多克隆抗体。Western blotting检测中华绒螯蟹不同组织EsSOX21b-like蛋白表达情况，结果显示EsSOX21blike蛋白在性腺中特异表达，尤其在精巢中表达量高，而在其他组织中不表达，推测EsSOX21b-like在性腺发育中具有重要的调控作用。

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（责任编辑 李楠）

Prokaryotic Expression，Antibody Preparation of Gonad-specific Protein EsSOX21b-like of the Chinese Mitten Crab Eriocheir sinensis

Yang Guocui Cui Zheng Qiu Gaofeng
（Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization Certificated by Ministry of Agriculture and Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

The Sox（SRY-related HMG-box）is a large family of genes which encode transcription factors with high-mobility-group DNA binding domain related to the SRY（sex determining region Y）. In previous studies we isolated and identified EsSox21b-like transcripts exclusively expressed only in gonads of the Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）， this study is to verify whether EsSOX21b-like protein is also specifically expressed in the gonad. Gene EsSox21b-like was cloned to expression vector pGEX-2T， the recombinant prokaryotic expression plasmid pGEX-2T-EsSox21b-like was constructed， then transferred into host Escherichia coli BL21， and induced by IPTG. SDS-PAGE analysis revealed that the fusion protein was expressed as inclusion body with the molecular weight of 54 kD. The recombinant proteins were subsequently purified by Ni+affinity chromatography. Then the purified protein was used to immunize rabbits for preparation of the EsSOX21b-like antibody. Western blotting detection showed the antibody specifically recognized the EsSOX21b-like protein in the gonad， with molecular weight of 28 kD，whereas no expression was detected in other tissues. The expression level of the target protein was much higher in testis than that in ovary. This result implied that the EsSOX21b-like protein could have a regulatory role in the gonad development.

Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）；EsSOX21b-like protein；prokaryotic expression；antibody preparation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.030

2014-09-16

国家自然科学基金项目（31272655），国家科技支撑计划项目（2012BAD26B04），上海市科委重点基础科研基金项目（11JC140 4600），上海高校水产学一流学科建设项目（B5005120001）

杨国翠，女，硕士研究生，研究方向：中华绒螯蟹生殖与发育；E-mail：554025117@qq.com

邱高峰，男，教授，博士生导师，研究方向：虾蟹分子遗传与繁殖；E-mail：gfqiu@shou.edu.cn