孙金旭
(衡水学院,河北衡水053000)
灵芝中灵芝酸的测定研究
孙金旭
(衡水学院,河北衡水053000)
利用HPLC法测定灵芝中灵芝酸含量的方法,此方法测定灵芝中灵芝酸含量重复性试验最大标准偏差为1.36%,峰面积与灵芝酸标品线性关系良好,标准曲线方程为Y=625.71x+82.857(R=0.998 2),加标回收率在97.04%~102.64%之间,此方法用于灵芝中灵芝酸含量准确、可行;经测定灵芝中灵芝酸为含量1.03 mg/g。
HPLC;灵芝酸;灵芝
灵芝酸是灵芝中除灵芝多糖之外的另一种重要的药理活性物质,灵芝酸一般分布在灵芝子实体的外周,日本以灵芝酸含量的高低来评价灵芝质量的好坏,他们认为含灵芝酸越高的灵芝,质量就越高[1]。近代研究表明,灵芝酸具有保肝、抗肿瘤[2-3]、降血糖[4]、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性,抑制胆固醇合成、镇痛、抑制血小板聚集、抗氧化等功能[5]。
近些年以来,测定灵芝酸类成分的主要方法为薄层层析法、紫外分光广度法,因灵芝酸成分种类繁多,结构相近,所以在资料控制和含量测定方面存在很大的困难,本研究建立了高效液相色谱法灵芝中灵芝酸含量的方法,以期快速、准确的对其进行测定。
灵芝酸标准品:购于国家标准物质网浓度为100 μg/mL;乙酸、乙腈(色谱级)无水硫酸钠:购于潍坊中汇化工有限公司。
高效液相色谱:Agilent1100美国;旋蒸仪(型号:EV311):莱伯泰科有限公司;电子天平:上海田宫称重制造有限公司。
1.3.1 灵芝酸标准液处理
准确秤取灵芝酸标准品10 mg,放入容积为100mL的容量瓶中,乙醇稀释至刻度,配置成浓度为1 mg/L的标准溶液,4℃冷藏备用。
1.3.2 灵芝酸的提取处理
适量秤取灵芝子实体,95%乙醇进行超声提取,灵芝子实体添加量0.05 g/L,提取温度,70℃,浸提时间12 h,浸提后过滤,取滤液,真空薄膜旋蒸处理,真空浓缩至干,得到提取物浸膏,该浸膏用氯仿溶解,反复用水萃取5次,取氯仿层,过滤,取滤液,用饱和NaHCO3溶液萃取3次,取NaHCO3萃取层,3次用盐酸调节至溶液pH为2~3之间,取沉淀物,沉淀物用氯仿溶解,真空薄膜旋蒸处理,浓缩至干,得到粗灵芝酸。
HPLC法测定灵芝中灵芝酸含量条件为:色谱柱Agilent Hpersil(5 μm 4.6×250 mm);流动相:2%乙酸:2%乙腈(体积比为7∶3);流速0.3 mL/min;进样量10 μL外标法定量;柱温30℃;检测波长待定。
为确定测定灵芝中灵芝酸高效液相色谱测定波长,以灵芝酸标准品为测定样品,紫外分光光度法进行其在200 nm~500 nm下的全波长扫描,扫描结果如图1所示。
图1 灵芝酸紫外全波长扫描结果Fig.1 The full wavelengh scanner result for Ganoderma lucidum acid
如图1所示,灵芝酸标准品在200 nm~500 nm下紫外扫描后,在254 nm处有唯一最大吸收峰,表明灵芝酸紫外测定的最适波长为254 nm。
HPLC法测定灵芝中灵芝酸含量条件为:色谱柱Agilent Hpersil(5 μm 4.6 mm×250 mm);流动相:2%乙酸:2%乙腈(体积比为7∶3);流速0.3 mL/min;进样量10 μL外标法定量;柱温30℃;检测波长254 nm,此测定条件下,灵芝酸标准品液相色谱图如图2所示。
图2 灵芝酸标品HPLC色谱图Fig.2 The HPLC spectra for Ganoderma lucidum acid
由图2可知,灵芝酸标准品在设定的测定条件下,在14.325 min处有单一峰,表明该测定条件适宜于灵芝酸的测定。
准确称取一定量的灵芝酸标准品放入25 mL的容量瓶中,乙醇稀释至刻度,分别配置成浓度分别为0.2、0.4、0.6、2.0、4.0、8.0、10.0 ug/mL的标准溶液,此7份标准液在上述色谱条件下进样测定,以峰面积为纵坐标,以灵芝酸浓度为横坐标进行回归,得到线性回归方程Y=625.71x+82.857(R=0.998 2),该回归方程在1 μg~100 μg的范围内,线性关系良好。
图3 标准曲线及方程Fig.3 The standard curves and equation
精密称取同一份经处理后灵芝酸标准品,均匀的分为5份,经HPLC测定其中灵芝酸含量,计算平均值及RSD值,结果如表1所示。
表1 重复性试验Table 1 Result of repetitive test
同一份灵芝酸标准品分5次进样后,其RSD值为1.36%,表明该方法的重复性均达到分析的要求。
取经处理的灵芝后,平均分成3份,经处理后,分别测定灵芝酸含量,分别取灵芝酸标准品配置成不同浓度,添加入处理液中,经过滤膜过滤后分别测定灵芝酸含量,计算回收率,结果如表2所示。
由表2可知,经加标后,灵芝酸的回收率在97.04%~102.64%之间,表明回收良好此方法适宜于灵芝中灵芝酸含量的测定。
表2 回收率试验Table 2 Recovery rates
灵芝经处理后,得到灵芝酸粗提物,灵芝酸粗提物经几次萃取后,HPLC法测定其中灵芝酸含量,HPLC色谱图如图4所示。
图4 灵芝酸测定高效液相图谱Table 4 The HPLC spectra for the Ganoderma lucidum acid
有图4可知,在设定的高效液相色谱条件下,物质之间分开效果较好,各物质均能独立成峰,且由出峰时间判断含有欲测定的灵芝酸,表明该高效液相色谱条件较适宜于灵芝中灵芝酸含量的测定。
精确秤取灵芝10.00 g,经处理后,进样测定灵芝酸含量,结果利用该方法测定出灵芝酸含量为1.03 mg/g。
利用HPLC法测定灵芝中灵芝酸含量,测定条件设定为:色谱柱Agilent Hpersil(5 μm 4.6 mm×250 mm);流动相:2%乙酸:2%乙腈(体积比为7∶3);流速0.3 mL/min;进样量10 μL外标法定量;柱温30℃;检测波长254 nm。研究表明:此方法测定灵芝中灵芝酸含量重复性试验最大标准偏差为1.36%,峰面积与灵芝酸标品线性关系良好,标准曲线方程为Y=625.71x+ 82.857(R=0.998 2),加标回收率在97.04%~102.64%之间,此方法用于灵芝中灵芝酸含量准确、可行;经测定灵芝中灵芝酸为含量1.03 mg/g。
[1]陈静,夏永辉,梁玲.灵芝有效成分生物活性作用的研究进展[J].云南中医中药杂志,2009,30(1):61-63
[2]郑琳,黄荫成.灵芝菌丝体活性三萜抗肿瘤活性的研究[J].农产品加工(学刊),2006(8):92-93
[3]Li C H,Chen P Y,Chang M,et,al Ganoderic acid X,a lanostanoid triterpene,inhibits topoisomerases andinduces apoptosis of cancer cells[J].Life Sci,2005,77:252-256
[4]金德宽.灵芝酸对人体糖代谢调节作用的研究[J].食品研究与开发,2012,33(11):202-205
[5]唐文.灵芝三萜类成分抑制拓扑异构酶Ñ活性的研究[J].上海应用技术学院学报:自然科学版,2011,11(2):90-93
[6]袁媛.高纯灵芝酸的分离纯化工艺研究[D].合肥工业大学,2007: 32-45
Determination of Ganoderma Lucidum Acid by HPLC
SUN Jin-xu
(Hengshui College,Hengshui 053000,Hebei,China)
The HPLC determination method for the determination of Ganoderma lucidum acid was established. The result showed that the maximum standard deviation of cholesterol content was 1.36%under this method for determination and Cholesterol content displayed an excellent linear relationship,the standard curve equation was Y=625.71x+82.857(R=0.998 2).The spike recoveries for cholesterol were between 97.04%and 102.64%,the method was feasibility and accurate for using to determine Ganoderma lucidum acid,the average contents of Ganoderma lucidum acid was 1.03 mg/g by HPLC determination.
HPLC;Ganoderma lucidum acid;Ganoderma lucidum
10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.004
孙金旭(1975—),男(汉),副教授,博士,主要从事发酵工程、食品等方面的研究。
2014-04-02