α2-f(56-57):Y S的ACE活性抑制作用及在酸奶中的应用

2015-10-27 02:00孙振刚武文起冯永强胡志和赵勇
食品研究与开发 2015年8期
关键词:降血压酪蛋白灌胃

孙振刚,武文起,冯永强,胡志和,赵勇

(1.天津海河乳业有限公司,天津300402;2.天津市食品生物技术重点实验室,天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津300134)

α2-f(56-57):Y S的ACE活性抑制作用及在酸奶中的应用

孙振刚1,武文起1,冯永强1,胡志和2,*,赵勇2

(1.天津海河乳业有限公司,天津300402;2.天津市食品生物技术重点实验室,天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津300134)

评价乳源肽α2-f(56-57):YS的血管紧张素转化酶(ACE)活性抑制作用及降压效果,并将其应用于发酵酸奶,制备具有降压作用的发酵酸奶。采用分光光度法检测α2-f(56-57):YS对ACE活性的抑制作用,用不同剂量的α2-f(56-57):YS及添加α2-f(56-57):YS的发酵酸奶灌胃原发性高血压大鼠(SHR),评价其降血压效果。结果表明,片段α2-f(56-57):YS具有很好的ACE活性抑制作用,其IC50值为11.89 μg/mL;体内检测表明,用低、中、高(1、3、9 mg/kg mb)剂量灌胃原发性高血压大鼠(SHR),均显示有降血压作用,在灌胃后4 h,其血压分别降低了18.25、31.38和36.88 mm Hg,8 h后恢复到初始血压值。添加α2-f(56-57):YS的发酵酸奶,以10 mL/kg mb的剂量灌胃SHR,在灌胃后4 h,对SHR的收缩压(SBP)降低了32.5mm Hg,8 h后恢复到初始值。因此,α2-f(56-57):YS具有降血压作用,应用于发酵酸奶中,可制备具有降压功能的酸奶。

ACE活性抑制肽;α2-f(56-57):YS;发酵酸奶;降血压

随着人们生活水平的提高,生活方式和饮食结构发生了巨大变化,现代文明病,包括肥胖症、糖尿病、心血管疾病等,接踵而来。其中,心血管疾病的发病率在我国呈逐年快速上升趋势。心血管疾病以冠心病为主,冠心病又称冠状动脉硬化性心脏病,而高血压是动脉粥样硬化的重要危险因素[1],且血压水平与心血管发病危险呈正相关[2]。在WHO/ISH、ESH/ESC和中国高血压治指南[3-5]中强调了控制收缩压的重要性,阐述了联合用药干预心血管危险因素的高血压治疗新观念,但降压药物都有一定的毒副作用[6]。

近年来研究发现,食物蛋白质水解后形成的一些小分子多肽具有明显的降血压作用,它与普通降压药物相比没有无毒副作用,且对正常的血压没有影响,因而成为目前抗高血压功能食品或药物研究的热点[7]。

目前,研究较多的是乳源降压肽,乳不仅能提供丰富的营养,而且还是许多生物活性肽的重要来源[8]。研究者采用蛋白酶水解的方法,从牛乳酪蛋白[9-13]和乳清蛋白[14-18]中分离出多种生物降血压肽,另外,还从发酵的乳制品中分离出多种具有降压功能的活性肽[19-24]。

本文利用胃蛋白酶和胰蛋白酶,先后水解乳酪蛋白,分离纯化获得肽片段α2-f(56-57):Tyr-Ser(YS),对其ACE活性抑制作用及降血压作用进行评价,将其与乳混合发酵,制作具有降血压功能的发酵乳,为功能性乳制品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

乳酪蛋白源肽α2-f(56-57):YS:天津商业大学生物技术与食品科学学院专业实验室制备,经HPLC和MS分析纯度大于95%;直投式乳酸菌菌种(HANSEN YFL812 50U):HANSEN公司;N-Hippuryl-His-Leu hydrate(HHL)、AngiotensinConvertingEnzymeACE:Sigma公司。

实验动物:原发性高血压大鼠(SHR),中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心;正常Wistar大鼠,北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 实验仪器

FLUKOFA-25均质机:上海弗鲁克流体机械制造有限公司;LRH-70生化培养箱:上海一恒科技有限公司;UV-2100紫外-可见分光光度计:日本Unico公司;BP-2006A型智能无创血压计:北京软隆科技有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 α2-f(56-57):YS片段的ACE活性抑制的体外检测

1.3.1.1 分光光度方法体外检测ACE活性抑制率

采用分光光度方法[25-26]体外检测ACE活性抑制率,具体方法见表1。

表1 ACE活性抑制体外检测方法Table 1 Detection method of ACE activity inhibition in vitro

硼酸钠缓冲液:含有0.3 mol/L NaCl的0.1 mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.3);HHL试剂:溶于硼酸钠缓冲溶液,配成浓度为5 mmol/L,分装后-20℃保藏;ACE试剂:将0.25U的ACE用2.5 mL的硼酸钠缓冲溶液溶解,配成0.1 U/mL,分装后-20℃保藏;抑制剂:用硼酸钠缓冲溶液溶解样品至不同浓度。

根据表1,将各试剂加入到5 mL离心管中混匀(每管做三组平行),反应结束后加入1.7 mL乙酸乙酯,经15s振荡、混匀后离心(4 000 r/min,15 min,4℃),吸取1.0 mL乙酸乙酯层于试管中,在120℃的烘箱中烘干30 min后,向试管中加入3 mL去离子水,检测在228 nm处的吸光度,其计算公式为:

式中:A为反应中ACE抑制剂和ACE同时存在的细光度;B为反应中不加抑制剂的吸光度,即对照;C为ACE和HHL空白反应的吸光度,即空白。

1.3.1.2 半数抑制浓度(IC50)的测定

称取α2-f(56-57):YS,分别配制成质量浓度为5、10、20、40、60 μg/mL的溶液,测定各溶液的ACE抑制率,并绘制ACE抑制率曲线,计算出IC50值。

1.3.2 添加α2-f(56-57):YS发酵酸奶制备

按照100 mg杀菌的鲜牛奶添加60 mg的α2-f(56-57):YS的比例混合,进行充分混合,接种0.06%直投乳酸菌(HANSEN YF-L812 50U),42℃发酵5 h,获得发酵酸奶。

1.3.3 α2-f(56-57):YS及其发酵酸奶的动物实验

1.3.3.1 实验动物分组

12周龄雄性原发性高血压大鼠(SHR)40只,体质量为(260±15)g,自由采食饮水,保持环境温度(23± 1)℃,相对湿度(60±5)%,预饲养1周。大鼠随机分为4组,每组10只,分别为空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,分别灌胃生理盐水(10 mL/kg mb)、低、中、高剂量的α2-f(56-57):YS(灌胃剂量为1、3、9 mg/kg mb)。另取Wistar大鼠20只,分为2组,分别作为空白组和正常对照组,灌胃生理盐水和高剂量α2-f(56-57):YS。灌胃后检测血压变化。

采用同一批SHR进行实验,间隔1周,待其血压恢复原值后再进行灌胃酸奶测试。取30只SHR大鼠,分为3组,每组10只,分别灌胃生理盐水、普通发酵酸奶和添加α2-f(56-57):YS的发酵酸奶,灌胃剂量为10 mL/kg mb。另取Wistar大鼠20只,分为2组,分别灌胃生理盐水和添加α2-f(56-57):YS的发酵酸奶。灌胃后检测血压变化。

1.3.3.2 动物血压测定

采用血压计,测定大鼠尾动脉收缩压(SBP)[27]。测定前,将大鼠固定于鼠网保温套中在39℃恒温预热,使尾动脉扩张,血流畅通。按照设计的剂量灌胃,每天灌胃1次,测定灌胃后1 h~8 h的尾动脉血压,连续测3次,取平均值。

1.3.4 实验数据处理

用SPSS17.0软件分析实验结果,比较各组与对照组之间差异的显著性,所得结果应用配对t检验,p<0.05表明统计学有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 α2-f(56-57):YS的ACE活性抑制作用检测

根据方法1.3.1,检测α2-f(56-57):YS对ACE活性的研制作用,结果见图1。

图1 α2-f(56-57):YS浓度与ACE抑制活性关系曲线Fig.1 Relationships between concentrations of α2-f(56-57):YS and ACE inhibitory activity

根据拟合方程y=-0.0087x2+1.3878x+27.959计算α2-f(56-57):YS对ACE活性的半数抑制率为IC50= 11.89 μg/mL,因此,该片段具有很好的ACE活性抑制作用。

2.2 α2-f(56-57):YS降压作用的体内实验

按照方法1.3.3(1)设计的剂量,灌胃SHR和 wistar大鼠,用BP-2006A型智能无创血压计检测灌胃后其收缩压(systolic blood pressure,SBP)的变化,结果见图2和图3。

图2 灌胃片段α2-f(56-57):YS对SHR血压的影响Fig.2 Antihypertensive effect of α2-f(56-57):YS on the SBP of SHR

图3 灌胃α2-f(56-57):YS对Wistar大鼠血压的影响Fig.3 Antihypertensive effect of α2-f(56-57):YS on the SBP of Wistar

由图2可知,与生理盐水组相比,三种剂量的α2-f(56-57):YS均具有很好的降血压的作用(p<0.05),在灌胃后4h,各剂量组均达到最好降压效果,低、中高三个剂量组分别降低了18.25、31.38和36.88 mmHg。4 h后,血压开始缓慢回升,8 h后基本恢复到原来水平。该结果表明,α2-f(56-57):YS片段在体内可经受胃肠环境的作用,结构不会发生变化,保持很好的降血压的功能。而对正常血压的wistar大鼠,在高剂量下灌胃,其血压无显著变化(p>0.05)(图3)。

2.3 添加α2-f(56-57):YS发酵酸奶的降血压作用

根据方法1.3.2制作添加α2-f(56-57):YS的发酵酸奶,按照方法1.3.3进行灌胃SHR,检测其血压变化,结果见图4。

图4 添加α2-f(56-57):YS发酵乳对SHR血压的影响Fig.4 Effect of containing α2-f(56-57):YS fermented milk on SHR systolic blood pressure(SBP)

与灌胃生理盐水相比,灌胃同等剂量普通发酵酸奶和添加α2-f(56-57):YS的酸奶均匀降压效果,在灌胃后4 h,对SHR的尾动脉收缩压(SBP),普通酸奶可降低9.8mmHg,而添加α2-f(56-57):YS的发酵酸奶可降低32.5mmHg,在4 h后,血压开始逐渐恢复,8 h后基本恢复到初始值。因此,添加α2-f(56-57):YS的发酵酸奶,具有很好的降高血压的效果。

3 讨论

ACE是一种多功能酶,在动物体内的升压系统肾素-血管紧张素系统(RAS)和降压系统激肽-激肽释放酶系统(KKS)中起着重要的调节作用,ACE对血压的作用见图5。

图5 血管紧张素转化酶抑制剂对血压的调节Fig.5 Angiotensin-converting enzyme inhibitors regulation on the blood pressure

血压的升高是由于该体系的平衡失调所致。在RAS系统中,当人或动物受激动因素的影响时,血浆中或组织中的肾素底物即血管紧张素原(angiotensinogen),在肾素的作用下,血管紧张素原C端失去亮氨酸(Leu),转化为血管紧张素Ⅰ(10肽)(angiotensin,AngⅠ)。在血浆和组织中,特别是在肺循环血管内皮表面存在ACE,Ang I在ACE的作用下,从其C末端去掉His-Leu生成血管紧张素Ⅱ(8肽),这是RAS系统中最强的血管收缩剂,能作用于小动脉,使血管平滑肌收缩,迅速引起升压效果;与此相反在KKS中舒缓激肽是降压物质,它能舒张毛细血管增加其通透性,使血压下降[28-29],ACE则使舒缓激肽失去C端的Phe-Arg而成为失活片段,引起血压升高。

因此,在从天然蛋白水解物中是否含有降血压的产物时,通常采用ACE活性抑制作用进行筛选。本文是在前期研究的基础上,获得具有ACE活性的酪蛋白水解产物[30-32],进一步分离纯化,获得纯化的片段,经MS检测,确定其氨基酸序列为YS(酪氨酸-丝氨酸),经过与酪蛋白一级结构的比对,确定为α2-f(56-57):YS。该片段经过体外检测,具有很好的ACE活性抑制作用(图1)。经过SHR的灌胃实验,发现在灌胃剂量在3 mg/kg mb~9 mg/kg mb具有很好的降血压效果(图2),且对正常wistar大鼠的血压无影响(图3)。按照动物实验的结果(9mg/kgmb),对于人的摄入量,按照60kg体重计算,每人每天喝100 mL酸奶,在酸奶中添加α2-f(56-57):YS的量设计为60 mg/100 mL。添加该剂量的发酵酸奶,经灌胃SHR实验,与普通酸奶相比,具有很好的降高血压的作用(图4)。

4 结论

酪蛋白先经胃蛋白酶水解,再经胰蛋白酶水解,在水解产物中分离获得的片段α2-f(56-57):YS,经体外和体内降压效果检测,对原发性高血压大鼠具有很好的降血压的功能,并对正常wistar大鼠的血压无影响。该片段应用于发酵酸奶中,可制备具有降压功能的酸奶。

[1]揭红波.浅谈心血管疾病的发病机理与预防[J].中外医疗,2011, (5):184

[2]陈绍行,沈卫峰.高血压治疗现状[J].国际心血管病杂志,2006, 33(2):67-69

[3]CHOBANIAN A V,BAKRLS G L,BLACK H R,et al.Seventh report of the joint national committee on prevention,detection,evaluation and treatment of high blood pressure[J].Hypertension,2003, 42(2):1206-1252

[4]Guidelines Committee.2003 European Society of Hypertension-European Society of Cardiology guidelines for the management of arterial hypertension[J].Hypertension,2003,21(6):1011-1053

[5]中国高血压防治指南修订委员会.2004年中国高血压防治指南[J].中华心血管病杂志,2004,32(12):1060-1064

[6]张元宏.高血压病的药物治疗新进展[J].实用医技杂志,2007, 14(3):382-385

[7]张源淑,邹思湘.酪蛋白源生物活性肽[J].国外畜牧科技,1998,25 (4):33-36

[8]A M Michaelidou.Factors influencing nutritional and health profile of milk and milk products[J].Small Ruminant Research,2008,79: 42-50

[9]MATSUMOTO H,SHIMOKAWA Y,USHIDA Y,et al.New biological function of bovine α-lactalbumin:protective effect against ethanol-and stress-induced gastric mucosal injury in rats[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2001,65(5):1104-1111

[10]MARUYAMA S,SUZUKI H.A peptide inhibitor of angiotensinⅠ-converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein[J].Agric Biol Chem,1982,46(5):1393-1394

[11]KOHMURA M,NIO N,ARIYOSHI Y.Inhibition of angiotensinⅠ-converting enzyme by synthetic peptides of human κ-casein[J].A-gricultural and Biological Chemistry,1990,54(3):825-836

[12]YAMAMOTO N.Antihypertensive peptides derived from food proteins[J].Biopolymers Peptide Science,1997,43(2):129-134

[13]姜瞻梅,田波,吴刚,等.酶解牛乳酪蛋白制备ACE抑制肽的研究[J].中国食品学报,2007,7(6):39-43

[14]顾瑞霞.乳与乳制品的生理功能特性[M].北京:中国轻工业出版社,2001:55-58

[15]李朝慧,罗永康,王全宇.乳清蛋白酶解制备ACE抑制肽的研究[J].中国乳品工业,2005,33(2):8-11

[16]FERREIRA I M P L V O,PINHO O,MOTA M V,et al.Preparation of ingredients containing an ACE-inhibitory peptide by tryptic hydrolysis of whey protein concentrates[J].International Dairy Journal, 2007,17(5):481-487

[17]COSTA E L D,GONTIJO J A D,NETTO F M.Effect of heat and enzymatic treatment on the antihypertensive activity of whey protein hydrolysates[J].International Dairy Journal,2007,17(6):632-640

[18]潘道东,郭宇星.瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳清蛋白制备ACE抑制肽的条件优化[J].食品科学,2009,30(11):138-143

[19]ROKKA T,EEVA L.Release of bioactive peptides by enzymatic proteolysis of Lactobacillus GG fermented UHT milk[J].Milchwissenschaft,1997,52(12):675-677

[20]NAOYUKI Y,ATSUKO A,TOSHIAKI T.Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790[J].J Dairy Sci,1994,77:917-922

[21]CUSHMAN D W,CHEUNG H S.Spectrophotometric assay and properties of angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. BiochemPharmacol,1971,20:1637-1648

[22]潘道东.抗ACE活性之瑞士乳杆菌的筛选[J].食品科学,2007, 28(2):145-148

[23]王宇.乳酸菌发酵乳抑制血管紧张素转化酶活性的研究[D].无锡:江南大学,2008

[24]赵树平,陈永福,孙天松,等.瑞士乳杆菌ND01(L.helveticus ND01)发酵乳中ACE抑制活性和γ-氨基丁酸的研究[J].中国食品学报,2009,9(6):48-53

[25]申晓文,牟光庆.酪蛋白源ACE抑制肽的评价方法和研究进展[J].食品工业科技,2010,31(9):375-381

[26]CUSHMAN D W,CHEUNG H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology,1971,20(7):1637-1648

[27]张燕,王红英,胡艳君,等.SHR大鼠血压尾套法测定影响因素探讨[J].西北药学杂志,2008,23(2):34-42

[28]张艳,胡志和.乳蛋白源ACE抑制肽的研究进展[J].食品科学, 2008,29(10):634-640

[29]张美莉.食品功能成分的制备及其应用[M].北京:中国轻工业出版社,2007:111-113

[30]杨铭,胡志和.酪蛋白双酶水解物ACE抑制肽的分离纯化[J].食品科学,2012,33(9):50-53

[31]王佳佳,胡志和.利用电子舌对富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物的脱苦评价[J].食品科学,2013,34(4):212-216

[32]王佳佳,胡志和,蒋毅.富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物及其功能性酸奶对SHR血压的影响[J].食品工业科技,2013,34(10): 345-356

Inhibition Effect of α2-(f56-57):YS on ACE Activity and Its Application in Yoghourt

SUN Zhen-gang1,WU Wen-qi1,FENG Yong-qiang1,HU Zhi-he2,*,ZHAO Yong2
(1.Tianjin Haihe Dairy Co.,Ltd.,Tianjin 300402,China;2.Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology,College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China)

Objective of this research was to evaluate inhibition effect of α2-f(56-57):YS,which from milk α2-casein,on ACE(angiotensin converting enzyme)activity,and its antihypertensive efficacy.And it was applied to produce yoghourt,which had antihypertensive efficacy.The inhibition effect of α2-f(56-57):YS on ACE activity was evaluated using spectrophotometric method.The antihypertensive efficacy of α2-f(56-57):YS and the yoghourt which contain α2-f(56-57):YS was evaluated by gavage SHR(pontaneously hypertensive rat)in different dose.Results showed that α2-f(56-57):YS had good inhibition effect on ACE activity in vitro,and its median inhibitory concentration(IC50)was 11.89 μg/mL.SHR was given α2-f(56-57):YS in different dose(1,3,9 mg/kg mb)by gavage,after given 4 hour,the blood pressure of SHR was reduced 18.25,31.38 and 36.88 mm Hg,respectively,and it was return to the initial blood pressure values after given 8 hour.SHR was given the yoghourt of containing α2-f(56-57):YS in 10 mL/kg mbby gavage,after given 4 h,its SBP was reduced 32.5 mm Hg,and after given 8 h,the SBP return to the initial value.Therefore,α2-f(56-57):YS had antihypertensive efficacy,and applied it in yoghurt,could give the yoghourt antihypertensive efficacy.

ACE inhibitory peptides;α2-f(56-57):YS;fermented yoghourt;antihypertensive efficacy

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.002

天津市科技支撑项目(14ZCZDNC00017);天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目(14JCZDJC34500)

孙振刚(1969—),男(汉),兽医师,学士,本科,研究方向:乳品加工。

*通信作者:胡志和(1962—),男,教授,硕士,研究方向:专用功能食品。

2014-12-08

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