蜜蜂个体发育过程中特定肠道菌的形成

郭军　李继莲　吴杰　编译

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京　100093）

蜜蜂个体发育过程中特定肠道菌的形成

郭军李继莲吴杰编译

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

（续2015年第1期）

3　结果

3.1qPCR结果

蜂群的来源对细菌数量没有显著影响，因此，来自不同群体的蜜蜂在后续分析中进行合并分析。工蜂日龄对BFG丰富度具有很大的影响，主要是由于NEWs采集于1日龄，几乎没有BFG种系型，只有较少的104个拷贝，而成年工蜂的16S rRNA基因的拷贝数可达106（P=2.4×10-106，Tukey's HSD法）。由于1日龄个体表现出较少的肠道菌且不能代表成熟工蜂，后续分析均采用存在1日龄和不存在1日龄个体进行统计分析。1日龄后，总BFG的16S rRNA基因拷贝随着日龄增加而增加，在9日龄和30日龄之间时超过2倍。

平均所有日龄后，Firm-5种系型的16S rRNA基因拷贝数比Beta或Gamma-1种系型要多（P= 0.0011，Tukey's HSD法）。Beta和Gamma-1种系型代表了23%和25%的总BFG 16S rRNA基因拷贝，而Firm-5种系型代表了52%。总的16S rRNA基因拷贝数量在不同肠道器官之间变化较大（P=6.6×10-84和9.8×10-80，Tukey's HSD法）。平均下来，在整个消化道内，BFG 16S rRNA基因拷贝总数在蜜囊中占0.007～0.062%，中肠中占1～4%，回肠中占4～10%，直肠中占87～94%。每个种系型的数量的描述只针对特定的肠道器官，而不考虑宿主的日龄和细菌类型。

只有1日龄样品未能表现出显著的日龄-肠道器官相互作用（P=1.6×10-33，Tukey's HSD）。所有的1日龄样品均表现出较低的丰富度。肠道器官的这三种细菌种系型的相对丰富度有所不同，另外，不论是否排除1日龄数据，器官-细菌种系型的交互作用均显著（P=3.7×10－5和2.4×10－5，Tukey's HSD法）。总BFG数量在不同肠道器官上有几个数量级的变化。另外，根据ANOSIM，蜜囊/直肠，中肠和后肠具有明显不同的菌群组成（P=＜0.0001；R=0.3575）。蜜囊和直肠的BFG组成差异不显著，并包括大部分的Firm-5种系型（69%和81%）。中肠中Gamma-1占主导地位（47%），Beta种系型在回肠中占主导地位（42%）。

3.2FISH显微检测

首先对不含FISH探针的工蜂肠道组织的自发荧光进行观察，5日龄幼虫和新出房工蜂的肠道样品中缺乏任何FISH探针，而哺育蜂和采集蜂的肠道对每个探针都产生信号。这些结果表明幼虫和很年轻的工蜂包含很少或没有细菌。在FISH调查中，NEWs，哺育蜂和采集蜂可被近似认为是与相应的已经知道日龄和行为的1，9和30日龄个体相对应。

与幼虫和NEWs相比，哺育蜂和采集蜂FISH图像表明其肠道内具有大量的细菌。相似的细菌定殖类型也在采集蜂和哺育蜂中观察到。哺育蜂/采集蜂的蜜囊中几乎没有细菌。哺育蜂/采集蜂的中肠中具有较小数量的细菌，包括Beta种系型，沿着整个长度的中肠分布，但细菌的加载量在向中肠后部分布时有所增加，在中肠后部，Gamma-1为优势细菌。

哺育蜂/采集蜂的回肠的细菌与中肠中的显著不同。沿着回肠的长度有较大的内陷并充满大量细菌细胞。这一细菌团主要有BFG种系型组成。另外，一些细胞只被通用细菌探针染色（eub339），Gamma-1和Beta种系型是回肠中细胞数量最多的细菌种系型。Beta种系型常直接与回肠内膜相联系，而Gamma-1种系型常发现于回肠内陷内。Firm-5种系型虽不是优势菌但其菌簇可以看到。哺育蜂/采集蜂的直肠能够容纳花粉细胞而有一定程度的自体发光，在大多数波长下用于激发FISH探针。然而，直肠中大量细菌群体大大超过花粉的数量并能很容易的通过图像鉴定出来。Firm-5是直肠中丰富度最高的种系型而只有很少数量的Beta和Gamma-1种系型可以观察到。另外，直肠中有很多细菌只能被通用探针示踪（eub339）而不是特定探针，这表明，很多直肠内的群体与Beta，Firm-5，或Gamma-1种系型无关联。我们还注意到Firm-5探针很特殊不能与Firm-4杂交，另外乳酸菌种系型可能在直肠中比较丰富。

3.3幼虫中细菌的PCR检测

对全部幼虫的DNA样品进行细菌PCR扩增，健康群来自3个地方，一群表现出感染欧洲幼虫腐臭病的症状。所有样品均具有Apis mellifera ef1α基因的阳性扩增，表明所提DNA达到PCR质量要求。采用通用细菌16S rRNA基因引物进行扩增，在35只健康个体中只有6只（3日龄幼虫，5日龄幼虫，或NEW）具有扩增产物。

相反，采用通用16S rRNA基因引物在大多数（10/ 14）先前检测出感染欧洲幼虫腐臭病的蜂群中产生出条带。这些蜂群中，3日龄幼虫大部分缺乏细菌（1/5阳性反应），5日龄幼虫全部含有细菌（5/5），并且大多数刚出房工蜂个体含有细菌（4/5）。几乎所有的种系型-特异性PCR结果都是阴性；然而，一些个体的Alpha-2.2种系型在所有健康蜂和感染欧幼病蜂群中呈阳性。有限的测序结果表明，在感染欧幼病蜂群中阳性通用16S rRNA基因产物表现出多样的细菌物种，包括常见的继发性感染源——粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。

3.4评估新出房工蜂中特定微生物的来源

所有的DNA样品都具有ef1α基因的阳性扩增，表明DNA具有较好的质量。由于笼子的蜜蜂仅仅被提供蜂粮作为食物，也是潜在的微生物来源，一些样品（3/ 12）产生真菌的扩增产物，而完全没有细菌存在（0/ 12）。来自蜂房中西方蜜蜂蜂粮含有细菌和真菌（2/2 samples）；然而，特征性的微生物种系型几乎不存。只有Alpha-2.2存在特征性的种系群。

所有在笼中饲养的刚出房的工蜂（具有哺育蜂）都对细菌呈阳性对真菌呈阴性。除了Alpha-1种系型外，哺育蜂几乎对所有的种系型都呈阳性。新出房工蜂暴露在这些哺育蜂周围，尽管哺育蜂含有一些特定种系型的共生菌，但这些NEWs并未像哺育蜂一样能够被这些共生菌定殖，NEWs与哺育蜂的肠道匀浆接触后对很多Apis mellifera的特定菌的种系型呈阳性。饲养在含有巢框的笼中的NEWs能够获得一些菌的种系型，但个体之间的菌的定殖不一致（不管它们是否与哺育蜂接触）。

4.讨论

从结果可以得出蜜蜂肠道定殖的菌群相对一致，主要是Beta，Firm-5，和Gamma-1这几种类型，并且受宿主日龄和肠道形态的影响。肠道菌群的丰富度和群落结构随着蜜蜂的生活史而变化，并且在成年蜂肠道不同器官部位也有所不同。在幼虫和新出房的工蜂中不存在肠道菌。肠道菌在成年工蜂肠道中的建立主要发生在子脾中的蜜蜂出房后与蜂箱接触和不同同伴之间的交哺作用；特定种系型的肠道菌在工蜂一生中保持稳定。

在先前的调查中观察到，所有自然状态下饲养的蜜蜂工蜂均栖息着特定种系型的肠道菌。通过焦磷酸测序技术进行的深度测序结果再次确认BFG种系型在蜜蜂肠道菌中占据优势，约占总的16S rRNA基因序列覆盖度的73%。Gamma-2也是主要的种系型之一，约占这些序列的23%。肠道中较少的菌落类型如双歧杆菌也始终存在可能也起到了主要的功能。个体之间这种种系型比例的差异在其他一些研究中也有观察到，这也可能反映出不同的DNA提取方法和步骤或不同蜂群之间的生物差异。

4.1成年工蜂

随着工蜂日龄的增加，它们需要更多时间进行箱外任务，并将暴露在不同食物和各种微生物环境中。总的来说，从箱内哺育子代到箱外环境中进行采集，成年蜂个体的微生物保持相对稳定。结果表明老年工蜂（30日龄）的肠道菌较多并且Gamma-1和Gamma-2比列较高（30日龄的样品聚类在9日龄样品的范围之外）。

蜜囊是肠道内的一种肌肉质的可膨胀器官，以适应采集蜂采集花蜜。虽然蜜囊经常含有营养丰富的花蜜并可作为微生物的能量来源，但它几乎不包含有细菌蜜囊这种频繁的填充和排空采集的花蜜到蜂箱中可扰乱微生物群落结构并阻止细菌定殖。或者是花蜜在蜜囊中酿造时由于加入了酶从而阻止了细菌的生长，这些酶也被认为是蜂蜜具有抗菌特性的主要原因。

中肠是成蜂的主要消化位点，在成蜂中肠内，上皮细胞分泌的酶可以消化食物，还能通过特化的中肠细胞和后肠上皮细胞进行吸收。不像其它肠道部位，中肠壁缺乏一个薄的内膜表皮层。相反，中肠上皮细胞可产生围食膜，围食膜是一种松散的薄膜可以辅助消化，保护上皮细胞以防粗糙的食物粒子。中肠上皮细胞可连续生产这种膜状物并在食物通过时脱落，这样可以阻止微生物附着。消化酶和围食膜的存在可以解释中肠中肠道菌比较贫瘠的原因（占BFG微生物总数的1-4%），尽管中肠是蜜蜂消化道中最大的器官。另外，FISH显微检测结果表明大多数中肠细菌都处于较后的位置，靠近幽门部，这表明，中肠的部分微生物可能在解剖切割中肠时从回肠转入到中肠后部。西方蜜蜂的回肠是在中肠和直肠之间的相对较小的器官，它具有较深的内折以便提供表面区域来吸收未被中肠收集的营养。尽管中肠比回肠大，但回肠中BFG的群体数量几乎比中肠大量两倍（占总BFG的5～10%）。与中肠相比，回肠的内膜折叠中具有丰富的附着点，使其有机会接触一些消化而未被吸收的营养。FISH图片进一步提供了附着点对细菌定殖的重要性证据，尤其是Beta和Gamma-1种系型。回肠的细菌群落相对于肠道壁来说表现为分层次的生物膜邻近宿主组部位具有Beta种系型生物膜结构，Gamma-1种系型分布在邻近Beta和回肠壁的厚垫上，此外，Firm-5种系型沿着回肠壁周围的小囊中分布。Beta种系型的附着可能使后面的种系型，如Gamma-1易于定殖和附着。产生的生物薄膜可能产生microgradients微梯度（如营养、氧气和pH），这些可能提供分散的生态位以利于各种底物的利用，类似于白蚁的腹部菌群。

直肠像蜜囊一样，具有一定的膨胀性，可适应更大的容量；这发生于工蜂连续保留消化废物直到它们飞出箱外排泄飞行时。在这相对静态的环境下，类似于白蚁的胃，直肠的内容物（主要是空的花粉外壁）可为细菌提供营养来源，因为发现于花粉壁的碳水化合物很难被蜜蜂消化。由于直肠营养丰富的环境，其中栖息着大部分始终稳定的微生物，占每只蜜蜂总的BFG 16S rRNA基因总数的87～94%。Firm-5种系型是直肠中的优势种群，并在直肠内腔中普遍存在，并散布于消化的花粉外壳上。总的来说，直肠包含了大多数BFG种系型的16S rRNA基因拷贝，并且还含有一些额外的细菌细胞，这些细菌只与通用真细菌探针杂交而不与特定的BFG探针杂交。这些非BFG细菌细胞大部分代表了除去特定特征微生物后的剩余的种系型（如Alpha-1，Alpha-2.1，Alpha-2.2，Bifido，Firm-4，和Gamma-2）。FISH显微镜方法对这些其它种系型的调查将阐明它们在蜜蜂肠道中的分布。

4.2幼虫

在动物中肠道菌普遍存在，基于非培养的方法对来自3个不同地理区域的健康蜜蜂群中幼虫的研究表明幼虫中存在很少或几乎没有肠道菌。蜜蜂幼虫中缺乏或不存在肠道菌似乎显得很奇怪，因为哺育蜂中具有特征性的肠道菌并通过口头饲喂幼虫。蜜蜂幼虫具有看不见的盲肠能够阻止消化废物排泄出去，直到化蛹前才第一次排泄，蜜蜂幼虫肠道中缺乏或不存在细菌在传统的细菌培养方法中也已经有报道。然而，其他一些依赖培养的研究提出幼虫肠道在自然状态下具有大量特征种系型的细菌。在这些研究中，幼虫未进行表面消毒，并且从子代巢房中的污染可能传播一小部分这些种系型的细菌到幼虫体表。大部分幼虫都是筛选自感染类芽孢杆菌的幼虫，观察到已知感染欧洲幼虫腐臭病的蜂群可潜在改变幼虫微生物的自然动态并允许微生物定殖。Mohr和Tebbe采用依赖培养的方法测定细菌16S rRNA基因但并未测定成蜂和幼虫的总的细菌，他们连续三年采样后发现成年工蜂肠道菌群保持一致（包括本文报道的类型），但幼虫与成蜂不同，并存在采样年份内和年份之间的变化，并缺乏特征性的微生物种系型。这种细菌存在的不规律性表明幼虫肠道微生物的存在来自其食物即蜂粮中。当前的调查表明，幼虫中的细菌除了Alpha-2.2外缺乏其他特征性细菌。Alpha-2.2可在未加工的蜂粮中发现，并在先前的研究中发现于各种蜜蜂和胡蜂种中。另外一个可能性是蜂粮中的细菌群落的变异可以解释为什么不同幼虫之间细菌的变化。

试图判定益生细菌的保护功能的研究主要集中在引入不同的乳酸菌（包括Firm-5）给幼虫并让这些幼虫感染病原菌，然而，这些实验依赖的菌株主要来自成年工蜂，因此并不能代表幼虫中自然存在的Firm-5。幼虫中细菌的缺乏表明幼虫具有不断增长的抑制抗菌能力或强烈免疫反应（由幼虫和/或通过哺育蜂交哺行为产生）。很多社会性昆虫的幼虫只被饲喂成年蜂加工过的食物，这就可能改变食物成分，如抑制微生物生长或富含特定的无病原菌/益生菌等物质，因此使幼体失去了感染病原体的机会。这可能对蜜蜂尤其重要，因为，很多破坏性的蜜蜂疾病都能侵染子脾（如真菌，细菌，蛛型纲动物和原生动物）。这些病原菌经常在蜜蜂消化食物时通过中肠壁并感染宿主组织。另外一个可能是幼虫肠道中的抗菌成分阻止了成年蜂肠道中存在的特定菌种系的增殖但未能阻止具有抗性的幼虫病原菌的定殖。

4.3刚出房工蜂

同预期的结果一样，新出房工蜂含有很少或不含细菌，因为蜜蜂经历了一个复杂的变态过程，这一过程可引起肠道内膜的脱落。与刚出房工蜂的工蜂相比，9日龄的成年工蜂已经具有一个发育完全的肠道菌群并与年老的工蜂并无显著差异。因为9日龄的个体中细菌已经完全定殖，在它们第一次采集飞行前已经在箱内获得了微生物群。目前对蜜蜂垂直和水平传播细菌的界限还比较模糊。工蜂个体可能并未从母亲体内获得细菌而是通过直接或间接的通过姐妹间或与蜂箱的接触而建立起自己的菌群。细菌的传递发生于蜂群内或超个体之间，如同白蚁和切叶蚁。因此，新出房的工蜂可能通过摄食巢脾中储存的蜂蜜和蜂粮及与老龄工蜂交哺花蜜来获得特定肠道菌，或者通过与巢脾的接触来获得。在通常的传递路线中种系型可能存在不同，在当前的调查中，蜂粮缺乏几乎所有的特征细菌种系型，并且并未将特征种系型的细菌传递给新出房工蜂。进一步地说，试验表明：蜜蜂特定细菌种系型可通过与巢脾接触形成，或从子脾中自然出房的蜜蜂通过暴露（及通过可能的交哺现象）到年老的伙伴中获得特定菌群。蜂群中蜜囊通常被称作“社会性的胃”，因为蜜囊储存的蜂蜜可在同伴蜜蜂个体之间共享。尽管蜜囊中只含有很少的微生物，一些细菌转运细胞可以在幼蜂肠道中定殖从而不断繁殖成一个完整的微生物群。而社会性交哺现象可能使同群内个体之间的微生物变得更加均匀。另外，食粪性，即通过直接或间接接触蜂箱表面的粪便，也是另一个潜在的传播途径。

4.4蜜蜂肠道菌的潜在作用

很多对动物的研究揭示肠道菌对宿主具有一些独特的有益功能。与蜜蜂关系较近的熊蜂肠道内也含有与Beta和Gamma-1相一致的种系型，此外，最近的研究还证实了肠道菌在成年熊蜂体内具有抵抗寄生性病原体的作用。这也进一步说明蜜蜂（Apis mellifera）的Beta或Gamma-1这两种种系型也可能具有抵抗疾病功能的可能性。由于蜜蜂这一重要传粉昆虫对农业生态系统的重要作用以及蜜蜂与人类食物供应的紧密联系，因此蜜蜂肠道菌的这些潜在有益功能至关重要。