蜂产品农兽药残留检测技术研究进展

柳青　罗红霞　句荣辉　马长路　王丽　贾红亮

（北京农业职业学院，北京　102442）

蜂产品农兽药残留检测技术研究进展

柳青罗红霞句荣辉马长路王丽贾红亮

（北京农业职业学院，北京102442）

蜂产品由于具有极高的营养价值而深受消费者的青睐。随着全球蜂产品消费量的逐渐扩大，农兽药残留的问题日益严重，危害人类的健康，影响蜂产品的出口。本文结合蜂产品农兽药残留的现状，重点阐述了农兽药残留检测的方法，并展望了未来蜂产品农兽药残留检测技术的发展趋势。

蜂产品；农兽药残留；检测方法

蜂蜜为绿色保健营养品，具有消炎、抗菌、抗肿瘤、调节血糖和血脂，促进组织再生及提高免疫力等作用。我国是蜂蜜产品的生产大国和出口大国，蜂蜜出口世界70多个国家和地区，主要集中在日本、欧盟和美国，占世界蜂蜜总产量的20%以上，出口金额1亿美元，居世界第二位［1］。近年来，蜂产品质量安全事件频发，农兽药超标已成为我国蜂产品在国际贸易中被预警通报或出口退货的主要问题之一。因此，蜂产品的质量安全需要从源头抓起，加大蜂产品中的质量监控及农兽药检测已刻不容缓。本文对蜂产品中农兽药残留的来源及检测技术现状进行深入分析，为蜂蜜农兽药残留检验方法提供了理论基础。

1　蜂产品农兽药残留的现状

1.1兽药残留

蜂产品的污染最主要是来自养蜂过程中用于防治病害的药物，不同的蜂产品所受到的主要污染风险不同，集中体现在兽药中抗生素残留。养殖户往往通过添加抗生素来防治蜜蜂疾病，使用违禁药物或长期超标使用兽药，在喂药期仍然摇蜜或采浆，导致蜂产品中兽药残留超标。2002年1月，由于“氯霉素事件”欧盟中止了进口我国蜂产品，并迅速波及美国、加拿大、日本、沙特、挪威等国家，相继提高了对中国蜂产品药物残留的检出限量要求，使我国蜂产品出口严重受阻，致使2003年上半年蜂产品出口量比上年减少44.34%，创汇额减少38.11%，蜂产品加工、出口企业损失惨重，蜂业面临严峻挑战。常用于养蜂业中的兽药包括四环素类（四环素、土霉素、金霉素、强力霉素）、氯霉素、磺胺类、甲硝唑类、大环内酯类和硝基呋喃及代谢产物。这些兽药残留严重影响蜂蜜的质量安全，危害人体的健康，造成经济损失，影响我国蜂产品的国际声誉。秦皇岛出入境检验检疫局国家蜂产品检测重点实验室对覆盖全国28省440家蜂产品企业，40万个蜂蜜样品检测，2003～2010年蜂产品中兽药残留检出率见后页表1。可知近年来硝基呋喃、硝基咪唑等兽药残留种类有所增加，而欧盟对此限量值分别为0.3和0.1μg/kg。因此，需采取多种手段，依靠现代检测分析技术严把蜂产品质量关。

1.2农药残留

蜂蜜中的农药主要来源于环境污染和蜜源植物用药，为了防治作物病虫害，蜂农使用有机氯、有机磷等除草剂以及植物生长调节剂。常见的农药残留主要有有机氯类、有机磷农药、氟胺氰菊酯、溴螨酯和蝇毒磷等，这些农药在蜂产品中的残留因对人体具有潜在的危害性而引起了人们广泛的关注，长期使用对环境和人体都会产生不良作用。有研究表明，有机磷类农药具有致癌性、细胞毒性、遗传毒性、致畸性和免疫毒性［3-4］。另一方面，蜂螨会产生抗药性，为了除螨效果和处于经济方面的考虑，蜂农会增加农药的用量，易进入蜂蜡而残留，使蜂箱里的蜂蜡、蜂蜜、蜂胶等受到污染。世界上许多国家已经规定和正在研究制定这些农药在蜂蜜中的残留限量。瑞士规定蜂蜜中溴螨酯、蝇毒磷和氟胺氰菊酯的最高残留限量分别为0.1 mg/kg、0.05 mg/kg和0.05 mg/kg。Martel AC［5］和Frazier M［6］等人报道了受测的100%蜂蜡样品中蝇毒磷和氟胺氰菊酯等杀螨剂均超标。Wallner K［7］和Tremolada P［8］等人也研究了农兽药在蜂蜡、蜂蜜和其他蜂产品中的残留。

2　蜂产品农兽药检测方法

2.1高效液相色谱法及其联用技术

高效液相色谱法（HPLC）是利用不同物质在不同相态中分配系数的不同，以流动相对固定相中的待测物进行洗脱，使待测物中的物质以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的方法。由于具有分离效率高、选择性好、检测灵敏度高等特点，在蜂蜜农药残留测定中的应用广泛。Kazuhiro Fujita等［9］人将样品经0.01 mol/L，pH4.0的Na2EDT A-Mcllvaine缓冲溶液提取后，通过双重苯乙烯二乙烯苯共聚合小柱及铜离子螯合亲和色谱柱净化富集，利用高效液相色谱荧光检测器检测，结果表明土霉素、四环素、金霉素的最低检测限分别达到0.5、0.7、0.9 ng/g。

表1　蜂产品中兽药残留检出率［2］

液质联用技术可获得单一分析技术难以达到的效果，采用固相免疫亲和柱净化样品可提高检测分析技术的特异性［10］。其中，高效液相色谱-串联质谱由于集高效分离和多组分定性、定量于一体，因此对高沸点和热不稳定化合物的分离和鉴定具有独特优势。可用于磺胺类、β-内酰胺类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类、酰胺醇类、硝基呋喃类、苯并咪唑类等，更重要的是不同种类兽药的同时检测。Manuel Lombardo-Agüí等［11］建立了超高液相色谱串联质谱法（UHPLCMS/MS）同时分析蜂蜜、蜂王浆和蜂胶中环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星、二氟沙星、氟甲喹、恶喹酸8种喹诺酮类兽药的方法，同时利用分散固相萃取的方法（QuEChERS）提取和净化，通过优化色谱条件，3min可使8种药物达到完全分离。Economou A等［12］研究了液相色谱串联质谱方法对蜂蜜中的7种磺胺类药物的影响，利用固相萃取技术进行样品净化，使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）在ESI正模式下分析，同时使用两种不同的同位素标记的内标物对结果进行校准。根据欧盟执行委员会2002/657/EC决议对该方法进行验证，结果表明平均回收率在1.5，2.5和5.0 mg/kg三个浓度水平置信区间在70%至106%范围内，相对标准偏差范围为6～18%，判定限和检测能力值范围分别为0.4～0.9和0.7～1.4 mg/kg。Kujawski M W［13］等人用LC-ESI-MS/MS检测了波兰蜂蜜中高灭磷、联苯三唑醇、西维因、毒死蜱、抑霉唑、吡丙醚、氟草唑酯等13种不同种类的农药残留，以磷酸三苯酯为内标物定量检测了40个实际样品，87.5%检测出有1～5种目标物。A.Carrasco-Pancorbo［14］等采用SPE-HPLC-TOFMS（液相色谱-四极杆-飞行时间质谱）测定蜂蜜中四环素类的兽药残留，其回收率为72～98%，相对标准偏差为2.51～6.42%（n=6）。

2.2毛细管电泳（CE）

毛细管电泳已发展成为分离科学中最活跃的领域之一，具有操作简单、色谱柱不受样品污染、分析速度快、分离效率高、样品量小、检测成本低等优点。毛细管电泳是利用样品组分在高压电场作用下迁移速率不同而达到分离的方法，根据离子到达检测器的时间不同，得到按时间分布的电泳图谱。毛细管电泳根据样品组分在背景缓冲液中所受作用的不同可以分为毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚集、毛细管电色谱等。但是因毛细管电泳迁移重现性低，灵敏度不如HPLC而在痕量残留分析中的应用受到一定的限制。Casado-Terrones S［15］报道了使用毛细管电泳测定蜂蜜中四环素类药物的方法，蜂蜜样品用C18小柱净化后，甲醇洗脱，用毛细管电泳-紫外检测器测定，8种四环素药物的检出限为23.9～49.3 ng/g。M.Herndndez等［16］用毛细管区域电泳技术测定了生物样品中的β一内酰胺、喹诺酮类抗生素。Fuh Ming-Ren S等［17］建立了肉制品中8种磺胺类兽药残留的毛细管电泳检测方法。分离电压25KV下，pH=6.5，35 mmol/L Na3PO4～H3PO4缓冲液固相萃取柱净化，在0.5～50 μg/ml线性范围内线性关系良好，回收率为80～97%，检出限在5～10 μg/kg范围内，符合欧盟的限量标准。

2.3免疫分析法（IA）

免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，有特异性强、灵敏度高（检测限可达1μg～1pg）、方便快捷、分析成本低等优点，正逐渐成为农兽药残留检测的热点。目前应用的残留免疫分析法有放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、固相免疫传感器等。目前最为成熟的技术是ELISA，已广泛用于蜂蜜、牛奶、果蔬等食品的检测。2005年，酶联免疫法制订为蜂蜜四环素类抗生素检测的国家标准。此外，美国和加拿大使用微生物拭子检测法（SwabTest on Premises）、牛的抗生素和磺胺实验法（CalfAntibiotic and SulfaTest）、快速抗生素筛选实验法（Fast Antibiotical Screen Test）；欧盟常用的方法为：德国三碟实验法（German Three Plate Test）、欧盟四碟实验法（European Union Four Plate Test）、新的荷兰肾实验法（New Dutch Kidney Test）等，国外许多公司如美国已将微生物法试剂盒商品化［18-19］。I.Guillén等［20］研究了侧流免疫层析法检测蜂蜜样品中残留的磺胺噻唑此方法中磺胺噻唑检测限为15 μg/kg，并且可在10 min内达到定性结果。

2.4气相色谱法及其联用技术

气相色谱法是一种以气体为流动相的柱色谱分离技术，适合溶剂沸点低而检测物质沸点高的体系测定，已经成为蜂产品农残检测分析中最常用的方法。在农残检测中，在残留浓度很低的情况下，不仅根据待测物在图谱上的保留时间，更主要是依据农药裂解的特征离子碎片，由质谱数据可准确判断化合物的结构信息。GC-MS（气质联用）技术很好的发挥了色谱的准确分离能力，同时提高了质谱的物质分析鉴别能力。低分辨GC-MS主要是四级杆质谱和离子阱质谱，高分辨主要是飞行时间质谱和扇形场质谱。Russo等［21］分别用GCMS和GC-ECD对蜂蜜中氟胺氰菊酯进行检测，色谱柱均为SE-54，检出限分别为0.018 mg/kg和0.008mg/ kg。Chauzat等［22］用CP Sil 8 CB/MS色谱柱，经GC-MS/ MS测定蜂蜡中18种杀虫剂的残留量，其检出限均为0.005 mg/kg。Frison等［21］通过GC-MS用DB-5MS色谱柱测定蜂蜡中氟胺氰菊酯的残留量，检出限为0.05 mg/kg。

2.5分子印迹技术（MIT）

分子印迹技术是通过人工合成手段将印迹分子与聚合物单体键合，获得在空间结构和结合位点上与模板分子完全匹配、具有分子识别功能的聚合物，该技术科用于药物、激素、蛋白质、碳水化合物的分离工作。Bhim等［23］制备了以硅胶键合的嗯唑酮的分子印迹聚合物，作为固相萃取剂识别了β-内酰氨抗生素类药头孢菌霉素和青霉素。夏环等［24］采用沉淀聚合法，以诺氟沙星为模板分子，合成了对氟喹诺酮类抗生素具有特异性识别的分子印迹聚合物，以该分子印迹聚合物作为固相萃取柱填料，建立了分子印迹固相萃取-高效液相色谱检测蜂蜜中三种FQs抗生素残留的方法。与Oasis HLB固相萃取柱相比，该分子印迹固相萃取柱具有更好的净化能力和更高的富集效率。其线性范围为0.125～12.5 mg/kg，检出限为9～12 μg/kg，回收率在96.5～104.1%范围内。

3　展望

当今在日益重视食品安全和环境保护的发展形势下，世界各国对蜂产品中农兽药残留的控制越来越严格，许多重要的分析技术在蜂产品农兽药残留分析中得到了广泛的应用。Reybroeck W和Sun X Y等［25］报道了新型生物与物理方法结合的农兽药检测技术，该方法几乎不使用有毒试剂，安全、快速、简单，有一定的抗干扰能力。另外一些新型的检测器和快速扫描测定技术［26］等也推动了蜂产品检测分析技术的发展。未来安全、快速、便携化的筛选性的同步多残留检测是国际食品污染物分析检测技术的主流趋势，将更加侧重于利用高效、高灵敏的联用技术进行多种类药物检测方法的开发，随着仪器分析技术的不断提高，在建立这些污染物质谱谱库的基础上，快速溶剂萃取、超临界溶剂萃取等样品前处理技术，超高效液相色谱串联质谱、超高效液相色谱-飞行时间质谱等高端分析检测技术的发展，同时力争实现分析过程自动化或智能化，以提高农兽药分析效率，降低蜂产品检测的成本。

［1］Wang Jie ke.The Present Condition and Existing Problems in China's exports ofBee products，Agricult Economy，2008，（4）：33-35

［2］曹彦忠.蜂蜜兽药残留分析技术研究及现状［J］.中国蜂业，2011，（29）：62-65.

［3］Sarabia L，MaurerI，Bustos-Obregon E.Melatoninprevents damage elicitedby theorganophosphorouspesticidediazinononthe mousetestis［J］.Ecotoxicol Environ Safety，2009，72：663-668.

［4］Yeh S P，Sung Tg Chang CC，et a1.Effects of an organophosphorus insecticide，trichlorfon，on hematological parameters ofthegiantfreshwaterprawn，Macrobrachiumrosenbergii［J］.Aquaculture，2005，243：383-392.

［5］Martel AC，Zeggane S，Auri&es C，eta1.Acaricide residues in honey and WaX after treatment of honey bee colonies with Apivar or Asuntol 50［J］.Apidologie，2007，38：534-544.

［6］Frazier M，Mullin C，Frazier J，et a1.What have pesticidesgot to dowith it？［J］.AmBee J，2008，148：521-523

［7］Wallner K，Varroacidesand their residues in beeproducts［J］.Apidologie，1999，30，235-248.

［8］Tremolada P，Bernardelli I，Colombo M，et a1.Coumaphosdistribution in the hiveecosystem：case study for modeling applications［J］.Ecotoxicology，2004，13：589-601.

［9］Kazuhiro Fujita，Hironobu Ito，Michiyo Ishihara et al.A nalysis of TraceResiduesof TetracyclinesinDark-ColoredHoneysby High-Perf ormance Liquid Chromatography Using Polymeric Cartridge and M etal ChelateAffinity Chromatography J Food Hyg.Soc. Japan，2008，49（3）：196-203.

［10］Carson M C，Breslyn W.Simultaneous determination of multiple tetracycline residues in milk by metal chelate affinify chromatography［J］.Journal ofAOACInternation at，1996，79（1）：2-4

［11］ManuelLombardo-Agüí，LauraGámiz-Gracia，Carmen-Cruces-Blanco，et al.Determination of quinolones of veterinary use in bee products by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a QuEChERS extraction procedure.Talanta 2012，93：193-199.

［12］Economou A，Petraki O，Tsipi D，et al.Determination of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination ofsulfonam ides，trimethoprimand dapsone in honey and validation according to Commission Decision 2002/657/EC for banned compounds.Talanta.2012，97：32-41

［13］Kujawski M W，Namiesnik J.Levels of 13 multi-class pesticide residues in Polish honeys determined by LC-ESI-MS/MS［J］.Food Control，2011，22：914-919.

［14］A.Carrasco-Pancorbo，S.Casado-Terrones，etal.Reversed-phase high-performance liquid chromatographycoupled to ultraviolet and electrospray time-of-flight mass spectrometry on-line detection for the separation of eight tetracyclines in honey samples［J］.Journal of ChromatographyA，2008，1195（1-2）：107-116.

［15］Casado-Terrones S，Segura-CarreteroA，Busi S，et al.Determination of tetracycline residues in honey by CZE with ultraviolet absorbance detection.Electrophoresis，2007，28（16）：2882-2887.

［16］M.Hernandez F Borrull and M C alull.Analysis of antiotics in biological samples by capillary electrophoresis.TrAC Trends in Analytical Chemistry.2003（22）：416-427.

［17］Fuh Ming-Ren S，Chu Su-Yi.Quantitative determination of sulfonamide in meat by solid-phaseextraction and capillary electrophoresis［J］.Analytica Chimica Acta，2003，499（1/2）：215-222.

［18］Scheer M.Studies on the antimicro bialagents against five pathogens isolated in calves in the Netherlands［J］.VetQuart，1990，12（4）：212-219.

［19］Catharina Y W A，wenhong L.A.bridging study between Liquid chromatography and microbial inhibition assay method for determiningamoxicillin residues in catfish muscle［J］.Journal ofAOAC International，1998，81（1）：3-5.

［20］Guillén I，Gabaldón J A，Núnez-Delicado E，et al.Detection of sulphathiazole in honey samples using a lateral flow immunoassay. Food Chemistry，2011，129：624-629.

［21］Russol MV，Neri B.Fluvalinate residues in honeybycapillarygas chromatography-Electron capture detec-tion-Mass spectrometry. Chromatographia，2002，55：607-610.

［22］Chauzat M P，Faucon J P.Pesticide residues in beeswaxsamples collected fromhoneybee colonies（Apis mellif-era L.）in France.Pest ManagSci，2007，63（11）：1100-1106.

［23］Bhim B P，Shouri B Preparation.Characterization and performance a silicagel bonded molecularlyimprinted polymer fou selective recognition and enrichment of β-laetam antibiotics.Reactive&Functional Polymers.2003（55）：159-169.

［24］夏环，王妍，荆涛.分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中三种氟喹诺酮类抗生素残留［J］.分析科学学报，2012，28（3）297-302.

［25］ReybroeckW，OogheS，DeBrabanderH，etal.Validationof thetetrasensor honeytestkit for thescreeningoftetracyclines in honey J Agric Food Chem，2007，55（21）：8359-8366.

［26］Sun X Y，Chen H，Gao H，et al.Screening of tetracycline residues in fish muscles by CCD camera-based solid-surface fluorescence.Agric Food Chem，2006，54（26）：9687-9695.

Advances of Studies on Techniques for Pesticide and Veterinary drug residues Determination in beeproducts

Liu Qing，Luo Hongxia，Ju Ronghui，Ma Changlu，Wang Li，Ja Hongliang
（Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing，102442 China）

Honey has a high nutritional value and health benefits，and favored by consumers.sales have increased. With theglobal beeproducts consumption，agriculture and veterinary drug residue problem becomes more and more serious，endangering human health，affected the export of bee products.In this paper，combined with the status quo of bee products farming veterinary drug residue，expounds the farming of veterinary drug residue detection methods，and prospects the future trend of the development of bee products farming veterinary drug residue detection technology.

beeproducts，pesticide and veterinary drug residues，determination techniques

北京农业职业学院技术推广与示范项目“蜂产品中农兽药残留的检测研究”，项目编号（XY-YF-13-10）

柳青（1982-），女，博士，讲师，研究方向为食品营养与检测，北京农业职业学院食品与生物工程系.Email：liuqingedu@126.com