粮食及其制品中真菌毒素的检测方法

真菌毒素是真菌产生的有毒次级代谢物，它广泛存在于粮油食品和饲料中，对人类和动物有害。一种真菌可能产生多种毒素，多种真菌可能产生同一种毒素。通常粮食或饲料中的真菌毒素并非单独存在，可能以一种或数种毒素为主，当不同毒素同时存在时，真菌毒素的毒性有累加效应（如黄曲霉毒素和赭曲霉毒素、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮等），但并非是相加或相乘的关系。真菌毒素的毒性变化很大，它取决于毒素的种类、数量、摄入量、持续摄入时间、环境因素（包括环境卫生、空气质量、温度、湿度）等。目前，全世界已经发现了400多种结构不同的真菌毒素，其中已经被分离鉴定的有20多种，危害较大的主要有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、伏马毒素和T2/HT2毒素等。其中，黄曲霉毒素是天然物中致癌性最强的毒素，被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，也是世界各地农产品及食品中最易受其污染的一种真菌毒素。据联合国粮农组织估计，全世界谷物供应的25%受真菌毒素污染，这些真菌毒素会通过被污染的谷物、饲料和由这些饲料喂养的动物所提供的动物性食品进入人们的食物链，从而对人畜表现出致癌性、遗传毒性和致畸性。目前，全世界已有100个国家规定了粮食中主要真菌毒素的限量，我国GB 2761-2011也明确规定了食品中真菌毒素的限量。因此，准确检测真菌毒素含量的技术手段变得极为重要。

真菌毒素的检测方法有很多种，比较经典且已经形成国家标准或行业标准予以实施的检测方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC-MS）、薄层层析法（TLC）、免疫亲和层析净化荧光光度法、酶联免疫法、胶体金检测条法等。

高效液相色谱法和液质联用法

高效液相色谱法是目前粮油食品中真菌毒素定量检测的主要方法，其检测过程一般包括样品粉碎、提取、过滤、净化和进样分析等步骤。由于高效液相色谱法对样品的纯度要求较高，因此净化过程是检测中的关键步骤。在我国新近颁布的真菌毒素检测标准方法中，主要采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱法，该方法已经成为国家标准的主流方法。

由于真菌毒素的种类较多，其化学性质各有特点，如有些对紫外光有响应，有些对荧光有响应，而有些只能衍生后进行检测，因此传统的液相色谱法很难同时检测多种毒素，而同种粮油或其制品常易被多种毒素同时污染，因此发展出了可同时测定多种真菌毒素的液质联用法（HPLC-MS）。中检环贸生物技术（北京）有限公司的Helix六合一真菌毒素免疫亲和柱适用于多种样品类型，如粮食谷物、坚果、食用油、奶粉、婴幼儿食品和香辛料等，能同时分离和纯化标准中规定的6种真菌毒素（AFLA+ZEN+DON+OTA+FUM+T2/HT2），将免疫亲和柱的高效纯化优势与质谱多种分析物同时检测的特点有效结合，样品处理液可直接应用于HPLC、LC-MS/MS、ELISA等多种检测方法。

薄层色谱法（TLC）

薄层色谱法是20世纪60年代发展起来的一种平面色谱技术，该方法针对不同样品，用适当的有机溶剂将待测毒素从样品中提取出来，经纯化后在薄层板上展开层析、分离，利用真菌毒素的荧光特性，与标准品比较进行定性和定量。该方法成本低，对设备和检测人员要求较低，但是该方法精确度低、操作过程复杂、分析结果的可重复性和再现性差，并且检测过程中需要使用高浓度的真菌毒素标准品（真菌毒素毒性较强，易对人体造成伤害，尤其是黄曲霉毒素，能够致癌），因此，近几年薄层色谱法的使用越来越少。

酶联免疫吸附法（ELISA）

酶联免疫吸附方法是以抗原抗体的特异性结合酶与底物显色反应为基础的检测方法。酶联免疫吸附法具有灵敏度高、干扰小、简便、快速、操作安全、特异性强、检测成本低等特点。该方法是筛选方法，2～3小时完成检测，需要借助酶标仪判读结果。

胶体金方法

胶体金技术又称侧流向免疫层析技术，是以胶体金作为示踪标记物应用于样品中待测物检测的一种免疫检测技术，可用于样品中待测物质的快速定性或定量检测，是一种稳定、灵敏的检测方法。该方法操作简单，无需专业培训，几分钟即可完成检测，非常适用于现场快速检测。目前，市场上的胶体金检测条大部分为定性检测条，无法进行定量检测。

美国Charm公司的Charm Rosa真菌毒素定量检测系统采用胶体金免疫层析原理，能够在5分钟内快速定量测定粮食及其制品中的真菌毒素，包括黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马菌素和T2/HT2毒素。该系统由检测条、孵育器和读数仪组成，其中检测条采用3线设计，包括2条检测线（T线）和1条质控线（C线），便于准确定量，增加动态检测范围；另外，检测条封闭包装，可防止检测条因暴露在空气中而被污染。孵育器为保温装置，能够促进样品流动并确保反应温度，该孵育器可自动倒计时，孵育结束后发出“哔哔”声。读数仪主要用于读取定量检测结果，检测结果可储存于仪器内，也可传输至电脑或打印机。

系统特点

·5分钟快速定量检测；

·拥有业内最齐全、最完整的霉菌毒素检测项目；

·样品制备过程简单快速；

·无需使用霉菌毒素标准品，对检测人员无毒无害；

·检测结果与国标方法具有较高的一致性；

·广泛适用于实验室、粮仓、农产品收购站等各种场合；

·产品通过USDA-GIPSA（美国农业部-美国谷物检验、批发及畜牧场管理局）和FGIS（联邦谷物检测局）认证；

·该方法为中国国家粮食局粮油检测行业标准。

高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC-MS）、免疫亲和层析净化荧光光度法等方法为国家标准规定的检测方法，结果准确，灵敏度高，但是对操作人员的技术要求较高，操作较为复杂，均需在实验室进行，且成本较高，无法适应现场快速检测的需要。新《食品安全法》明确规定，食品药品监督管理部门可以采用国家规定的快速检测方法对食用农产品进行抽查检测，可见国家对快速检测方法的认可。准确、简单、高效、低成本的现场快速检测方法是真菌毒素检测的发展趋势。