宝坻大蒜再生体系优化及性能评估

范宝莉 王珍 任春雪 顾增惠 刘晓颖 王振英

（天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

宝坻大蒜再生体系优化及性能评估

范宝莉 王珍 任春雪 顾增惠 刘晓颖 王振英

（天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

通过对分化培养基和生根培养基进行优化，完善了宝坻大蒜再生体系，确定最佳分化培养基为MS+6-BA 5.0 g/L+ NAA 1.0 g/L，最佳生根培养基为无激素的MS培养基。对再生植株进行细胞学鉴定及田间评估，未发现染色体变异，再生植株田间特性有利于提高光合效率。

宝坻大蒜；再生植株；叶夹角；鳞茎

大蒜（Allium sativum L.）属于葱属葱科家族，是最重要的蔬菜作物之一，可用于烹饪和医疗。近年来，由于其具有抗氧化、癌症预防、肝脏保护、免疫调节和降低心血管疾病等功能［1-3］，其保健和药用价值已被广泛研究；大蒜含有超过2 000种生物活性组分［4］，还含有高浓度含硫化合物，如大蒜素［5］。

栽培大蒜是无性繁殖作物，由于其性器官不育，大约10%的收获作物用于接下来的大田作物生产，且长期无性繁殖导致鳞茎易感染多种病毒，造成大蒜种性退化，使品质降低产量下降。微繁技术可用来加速无性繁殖以生产大量的健康脱毒植株；并用于大量无性繁殖植物材料的低温贮藏［6］。

植物细胞组织培养技术在植株再生和品种改良方面起到重要作用。近年来研究者主要以鳞茎［7-11］、气生鳞茎［12］或花苞［13，14］等为外植体进行体外培养，建立了较为完善的组织培养体系。宝坻大蒜“六瓣红”是津沽名优特产，1973年宝坻大蒜种植面积被列入国家计划并出口东南亚等国家，但宝坻大蒜的微繁研究相对滞后，主要以发芽叶［15，16］、花梗［17］等为外植体初步建立了植株再生体系，后期的试管苗移栽及大田评估鲜见报道。本研究在李转春等［16］的体系基础上，进一步优化植株再生体系，提高了再生效率，并对移栽后的植株进行细胞学研究和田间评估，为宝坻大蒜微繁技术的完善和种质创新奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料为宝坻大蒜“六瓣红”。

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒 大蒜的鳞茎于4℃冷藏2周以激活发芽过程，选取生长健壮、无病虫害的大蒜蒜头，剥去外面鳞叶，流水冲洗20 min左右，用蒸馏水冲洗1遍，0.1%的升汞消毒10 min，无菌水冲洗3次，滤纸吸干，再将其放在75%的无水乙醇中消毒10 min，用无菌水冲洗3次，滤纸吸干，备用。

1.2.2 微繁体系各培养基组分 参照李转春［16］的方法略作改动，并对分化培养基和生根培养基进行筛选和优化（表1）。以MS培养基为基本培养基，添加不同种类和浓度的激素，pH值为5.8；高温高压灭菌20 min；待冷却至60℃时，分装到200 mL的组培瓶中，每瓶约40 mL，封口备用。

表1 微繁体系培养基组分

接种前，紫外消毒30 min。切取大蒜发芽叶，接入愈伤组织诱导培养基，放于人工气候箱中，日温25℃，夜温20℃暗培养。

每隔20-25 d继代1次，选取继代2次的愈伤组织转入分化培养基，每瓶10块，每个处理20瓶，共设3个处理。培养条件为日温25℃，夜温20℃，光强1 500 Lx，光照时间14 h/d。将分化出不定芽的绿苗转入生根培养基，诱导生根，生根培养基共设3个处理，记录生根时间及生根率。

1.2.3 试管苗的驯化及移栽 生根后的试管苗，待其长到3片真叶、生根3-4条时，室温开瓶炼苗，7-10 d后从试管中取出，洗去根部培养基将其移栽至灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土（1∶3∶6）中，移栽后保持日温25℃，夜温15℃，在组织培养室中放置30 d壮苗，之后移栽到大田。

1.2.4 细胞学研究 为了确定本研究中大蒜愈伤组织途径再生植株的遗传稳定性，取不同再生阶段分生组织（愈伤组织、分化后的不定芽、试管苗根尖）进行细胞学观察。将不同材料固定于卡诺固定液中，1 mol/L HCl 60℃水解8 min，卡宝品红染色8 min，压片镜检。

1.2.5 田间数据评估 随机选取田间种植的栽培大蒜植株以及再生植株各30株，进行数据测量及生理生化指标测定，计算平均值。

株高：植株收获后，测量植株基部到最高的叶片的距离。叶夹角：收获后，测量植株倒3叶与茎的锐角角度。叶间距：收获后，测量植株倒2叶与倒3叶之间的距离。鳞茎直径：用游标卡尺测量收获植株鳞茎直径。

叶绿素含量：田间栽培16周后，对栽培大蒜、再生植株分别进行取材，用打孔器在第3片叶子的4-6 cm、6-8 cm和8-10 cm叶段分别进行打孔，将打下来的小圆片分别装入管中，标记1，2，3管，向每管中加入浸提液（丙酮∶乙醇=1∶1）10 mL，放置在黑暗条件下72 h，分别测量每管在663、645 nm处的分光光度值，计算叶绿素含量。每管重复测量3次，取平均值。

2 结果

2.1 试管苗的形成

大蒜发芽叶接种28 d左右可以诱导出愈伤组织；将继代两次的愈伤组织接入分化培养基，每瓶10块愈伤组织，每处理20瓶，共设3个处理；分化后的苗接入生根培养基，每处理50管，共3个处理。试管苗形成过程如图1所示，愈伤组织分化率见表2，生根率见表3。

表2 不同培养基对分化率的影响

表3 不同培养基对生根率的影响

大蒜发芽叶横切为2 mm左右薄片（图1-A）接种1周后，外植体表面结构疏松，周围组织变成浅黄色，有一定的光泽。接种2周后，有微小的愈伤组织颗粒形成。接种4周左右，外植体表面已经形成雪花状、质地疏松的愈伤组织（图1-B）。

图1 试管苗形成过程

将愈伤组织接入继代培养基，选择继代2周的愈伤组织分别接入3种分化培养基，在分化培养基中首先形成绿点和嫩芽（图1-C），最终形成健壮的苗（图1-D）。每天观察分化情况，每3 d记录数据，计算分化率。第一次出现绿点的先后顺序分别为分化培养基3、2和1，时间分别为8、11和16 d。从表2可以看出，分化培养24 d后，分化培养基3的分化率达到了50%，而分化培养基1的分化率为26%，分化培养基2的分化率为35%，当愈伤组织分化培养39 d后，分化培养基3的分化率达到了100%，分化培养基1为68%，分化培养基2为80%。最终分化培养基1的分化率为74%，分化培养基2的分化率为94%。结果表明，分化培养基3的分化率最高，且分化速度快。细胞分裂素可促进细胞生长和分化，诱导不定芽的形成。因此，适当提高细胞分裂素与生长素的浓度比，有利于不定芽的分化。

将分化后的健壮苗移入生根培养基中，由表3可见，生根培养基1中在6 d左右即可生根，48 d后生根率91.1%，根系发达且均为实生根（图1-E）；生根培养基2中9 d左右生根，最终生根率63.3%，根系少，主要形成小鳞茎（图1-F）；生根培养基3中的生根速度最慢（图1-G），且最终生根率仅为32.1%。因此，选用不添加任何激素的MS培养基为最佳生根培养基。

2.2 试管苗的炼苗及移栽

生根后的试管苗，待其长到3片真叶、生根3-4条时，室温开瓶炼苗，7-10 d后将小植株从试管中取出（图2-A），洗去根部培养基将其移栽至灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土（1∶3∶6）中（图2-B），移栽后保持日温25℃，夜温15℃，在组织培养室中放置30 d壮苗，之后移栽到大田（图2-C），移栽成活率在95%以上。

图2 试管苗炼苗

2.3 细胞学试验结果

为了检验试管苗的遗传稳定性，对组织培养不同时期以及正常栽培的大蒜根尖进行细胞学分析。图3显示了栽培大蒜根尖不同时期染色体以及试管苗形成不同时期染色体观察结果。试管苗不同时期染色体数目及形态结构正常，每个时期随机选取10个视野（不重复），每个视野观察100个细胞，所观察的细胞样本数量至少为1 000个，未观察到染色体异常现象，说明本研究的培养体系既利于试管苗生长，提高了试管苗形成比率，又不影响试管苗的正常发育，未发生遗传变异现象。

图3 栽培大蒜根尖及试管苗不同时期染色体

2.4 田间数据评估

随机选取了栽培大蒜和再生植株各30株，测量了成熟植株的株高、叶夹角、叶间距、鳞茎直径，测定了叶片叶绿素含量，计算平均值，数据见表4。图4显示了两种大蒜植株形态（图4-A，图4-B）及再生植株鳞茎状态（图4-C，图4-D）。普通栽培大蒜的株高、叶夹角和鳞茎直径较再生植株大，叶间距与叶绿素含量较再生植株小。再生植株叶夹角小，上部直立，透光率高，可以为中下部叶片提供更多光照，提高植株净光合速率；叶间距大利于增强通风透光性，光合活性增强；叶绿素含量高，能够提高光合作用效率，利于植株生长。再生植株鳞茎直径稍小于普通大蒜，但蒜瓣紧实，分瓣情况为典型的四六瓣，符合宝坻大蒜特征。

表4 田间试验数据

图4 成熟的大蒜叶片及鳞茎

3 讨论

组织培养方法是大蒜等无性繁殖作物在短期内大量繁殖的有效途径，优化组织培养体系能够提高大蒜的再生效率，改善再生植株品质，最终用于作物育种改良。本研究在前人的经验基础上，进一步优化组织培养体系，改良分化培养基和生根培养基激素配比，大大提高了分化效率和生根效率，并缩短了分化及生根时间。Motte［18］认为芽再生是微繁过程中很重要的一步，富含细胞分裂素的芽诱导培养基利于不定芽的形成。本研究在前期工作的基础上，进一步提高了细胞分裂素含量，增加了细胞分裂素与生长素的浓度比，从而缩短了分化时间，提高了分化效率。利用无激素的MS培养基诱导生根，利于实生根的形成。本研究对微繁过程的不同阶段分生组织进行细胞学观察，未发现异常染色体。

再生植株性能评价中最为重要的是大田性能的评估，以确保其是否优于传统作物。前期的研究主要集中于实验室中再生体系的优化，有关大蒜再生植株在大田种植中的性能评估报道较少，还未见宝坻大蒜的相关报道。本研究首次报道了宝坻大蒜在大田种植中以及鳞茎成熟后的相关指标，进一步完善了宝坻大蒜再生植株的特性评价。再生植株与普通大蒜植株相比，叶夹角减小、叶间距与叶绿素含量增大，这些特征有利于更好地利用光能，提高光合效率，进一步提高产量。王元东、吕丽华等［19，20］认为叶夹角小的植株，上部叶片直立上冲，截光能力低，群体透光率高，可以为中下部叶片提供更多光照，便于叶片充分高效利用光能，提高植株净光合速率，从而提高产量。叶间距越大，越有利于减小田间郁闭，增强群体通风透光性，中上层叶片受光条件越好，越有利于叶片达到较高的光合活性；同时也越有利于中下部叶片的光合作用，增强全株的光能利用率。同时叶绿素含量较普通植株高，有利于光合效率的提高。组织培养过程中充足的营养供给使再生植株对外界胁迫具有更强的抵御能力。本研究补充完善了宝坻大蒜微繁体系，为宝坻大蒜快繁和种质创新打下更为坚实的基础。

4 结论

本研究以宝坻大蒜为试验材料，对分化培养基和生根培养基进行优化，进一步完善了宝坻大蒜再生体系。最佳分化培养基为MS+6-BA 5.0 g/L+NAA 1.0 g/L，最佳生根培养基为无激素的MS培养基，分化率为100%，生根率为91.1%。对植株再生不同阶段的分生组织进行细胞学观察，未发现染色体变异现象。

分别对栽培大蒜和再生植株进行田间评估，再生植株的株高、叶夹角和鳞茎直径小于栽培大蒜，叶间距与叶绿素含量大于栽培大蒜，利于提高光合效率。

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（责任编辑 李楠）

ISAAA信息

2014年是转基因作物商业化的第19年， 转基因作物种植面积持续增加。28个国家（20个发展中国家， 8个发达国家）的1 800万农民种植了1.81亿公顷（ 4.48亿英亩） 的转基因作物， 比2013年27个国家的1.75亿公顷有所增长。中国转基因作物种植面积世界排名第6位， 种植面积为390万公顷 ， 种植的转基因作物包括棉花、木瓜、白杨、番茄、甜椒。

孟加拉国是种植转基因作物的新成员。2013年10月， 孟加拉国首次批准了Bt 茄子的种植， 小农户们于2014年 1月开始 Bt 茄子的商业化。 美国于2014年11月批准了另一种粮食作物 InnateTM马铃薯， 相比传统马铃薯， 它的潜在致癌物质丙烯酰胺含量更低， 挫伤损失更少。2014年11月， 一种新的转基因作物苜蓿（事件KK179） 在美国获批种植， 其木质素减少了22%， 从而具有更高的可消化性和生产率。在美国种植的第一种耐旱玉米2014年的种植面积比2013年的5万公顷增加5倍以上， 达到27.5万公顷。

转基因作物在1995年至2014年间产生了多重重大效益： 采用转基因技术使化学农药的使用率降低了37%，作物产量提高了22%， 农民利润增加了68%。

（数据来源： 基因农业网 ）

Optimization and Performance Evaluation of the Regeneration System of the Baodi Garlic

Fan Baoli Wang Zhen Ren Chunxue Gu Zenghui Liu Xiaoying Wang Zhenying
（College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

The regeneration system of Baodi garlic was improved by optimizing the differentiation medium and rooting medium. The optimal differentiation medium was MS +6-BA 5.0 g/L + NAA 1.0 g/L and the best medium for rooting was MS medium without hormones. No chromosomal aberration was observed according to the results of the cytological identification and field assessment of the plant regeneration. The field features indicated the improvement of the photosynthetic efficiency of the plant regeneration.

Baodi garlic；plant regeneration；leaf angle；bulb

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.014

2014-07-25

天津市农委重点项目（5KN13001），天津师范大学应用开发研究基金项目，天津市科委面上项目（14JCYBJC29900）

范宝莉，女，硕士，高级实验师，研究方向：细胞遗传学；E-mail：fbl1216@126.com

王振英，女，博士，教授，研究方向：植物抗性分子生物学；E-mail：skywangzy@mail.tjnu.edu.cn