透明颤菌血红蛋白的结构功能和应用进展

陈云美 徐海洋 王世明

（南京理工大学分子代谢中心，南京 210094）

透明颤菌血红蛋白的结构功能和应用进展

陈云美 徐海洋 王世明

（南京理工大学分子代谢中心，南京 210094）

透明颤菌血红蛋白（VHb）是科学家发现的第一种微生物血红蛋白，它的结构、生化功能以及表达调控机制都已经得到广泛的研究。VHb可以在很多宿主细胞中表达，通过促进氧的输送增强呼吸和能量代谢，以提高许多有用的代谢产物（抗生素、蛋白质、聚合物等）的产量和宿主抗逆性，还能降低有害化合物的毒害。重点从VHb的功能与结构、在提高微生物代谢产物的产量，以及对动植物某些特性的影响和增加生物修复能力等方面的应用进展进行了综述，并对VHb在植物代谢和动物代谢中具有很大的发展空间进行了展望。

透明颤菌血红蛋白；生物制剂；代谢产物；生物修复；发酵工程

1 透明颤菌血红蛋白（VHb）简介

透明颤菌是一种革兰氏阴性好氧丝状菌，首先发现于1870年，但直到1949年，Pringsheim等［1］才进一步对该菌进行纯培养，并将其定义为一个新的菌科：Vitreoscillaeeace。透明颤菌非常重要的一个特性是它可以合成一种血红蛋白类似物。1974年，Webster等［2，3］从Vitreoscilla菌中提取纯化得到此蛋白，并在1978年将其命名为“细胞色素o（cytochrome o，Cyo）”蛋白。1986年，Wakabayashi等［4］完成了对Cyo的氨基酸测序，并将Cyo的146个氨基酸与5种动植物的血红蛋白进行比较发现，Cyo与其他真核生物的血红蛋白（Hbs）拥有较高的相似性，特别是与黄羽扇豆血红蛋白的相似性高达24%。在综合了蛋白质初级结构、光谱性质、氧结合动力学等一系列特征后确定了Cyo的结构，并将Cyo重新命名为透明颤菌血红蛋白（VHb）。VHb是迄今发现的唯一一种原核生物血红蛋白。

2 透明颤菌血红蛋白的结构与功能

天然的VHb以同型二聚体形式存在，由两个完全相同的相对分子量为15 775的亚基和两个b型血红素组成。每个亚基由146个氨基酸残基形成6个α-螺旋区（A、B、E、F、G和H），其三维结构见图1［5］，而真核生物的血红蛋白有8个α-螺旋区（A、B、C、D、E、F、G和H）。所有的血红蛋白都含有一个近侧His（F8）残基与血红素铁结合，大部分血红蛋白的远侧都含有另一个His（E7）残基，通过His（E7）残基与氧结合形成氢键来维持其稳定。但是VHb氨基酸残基E7位置是Gln，又因为多肽片段Phe-CD1到Leu-E1的基因片段之间没有能力形成α-螺旋，进而导致Gln-E7离开了血红素囊区域，因此它不能与环境中氧结合形成氢键，最终使二者的亲合力变弱，加快氧的传递速率。1998年，Dikshit等［5］通过定点突变的方法将VHb蛋白E7位点的Gln变成Leu或者His发现，VHb蛋白的生物活性未受影响，由此断定VHb蛋白血红素跟氧的结合不发生在E7位置，这跟其他血红蛋白不同。

图1 VHb的三维结构（颜色标识见电子版）

蛋白质的结构是其功能的物质基础。1997年，Tarricone等［6］认为B10位点的Tyr在维持氧的稳定性上具有重要作用，将Tyr突变成Phe，VHb蛋白的结构保持不变，但是若将Tyr突变成Ala，会使VHb蛋白的末端结构发生重组［6，7］。2008年，Kaur等［8］将VHb蛋白G5位点的Tyr突变成Phe或者Leu，结果导致VHb氧结合能力和一氧化氮双加氧酶（nitric oxide dioxygenase，NOD）活性受到明显的影响；若将H12位点的Tyr突变成Phe或者Leu，对VHb的氧结合能力影响较小，这却与分子模型推测的结果不一致（TyrH12Leu突变可能会增强血红素铁氧的扩散）。如果能研究透彻VHb不同位点突变后功能的改变，则会对蛋白质结构和功能之间的关系提出新的见解，并且突变后的VHb蛋白更有利于其在生物工程上的应用。

研究发现，VHb蛋白在不同的环境条件下可呈现3种不同的状态，即还原态、氧合态、氧化态。3种状态可以相互转化，其中还原态是生理活性态，此时VHb的铁原子处于亚铁状态，可以与环境中的氧可逆性结合；而氧合态是还原态和氧化态的过渡态，是富氧条件下的表现形式，氧合态的形成是VHb蛋白发挥生理功能的必需条件。VHb与氧形成氧合态，并以这种状态参与跟氧有关的代谢途径，介入代谢途径中的某些关键步骤，然后氧合态的VHb通过跟氧的解离，将氧传递给呼吸链，调节末端氧化酶的活性，提高氧化磷酸化的效率，改变在贫氧条件下细胞原有的代谢途径，以至改变某些基因的表达，更有利于菌的生存和目的产物的高效表达。从VHb结合氧的动力学参数来看，和其他血红蛋白相比，VHb与氧结合的速率常数（kon=78/μmol/L/s）处于平均水平，反应了VHb对氧较强的亲和力；而VHb与氧解离速率常数（koff=5000/s）却比其他血红蛋白高出上千倍，反应了VHb更容易释放大量的氧（表1）。因此，VHb蛋白最初的功能只是在氧含量较低的情况下结合氧并且将氧传递到末端氧化酶以增加氧化磷酸化［9］，随着研究的进一步深入才发现了一些别的与氧相关的功能。

表1 各种血红蛋白与氧反应的动力学常数［10］

虽然VHb的功能是协助氧进入细胞，但在一些宿主菌中却可以通过过量表达VHb进行氧化应激保护［10］。后来发现这是因为VHb改变了宿主菌的转录调节因子OxyR的氧化还原状态，激活细胞的抗氧化调节子［11］。有研究发现VHb还与负责氧应答的转录调节因子 Fnr相互作用，vgb启动子除了有Crp，Fnr和ArcA的结合位点，还有OxyR调节蛋白的结合位点。因此VHb通过改变细胞的氧化还原态来改变细胞的代谢。

3 透明颤菌血红蛋白的应用

在研究VHb结构和功能的同时，VHb的应用研究也在稳步向前发展。VHb的宿主范围非常广泛，在很多宿主细胞内都能成功表达，包括微生物（大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌、假单胞菌、霉菌和酵母菌等），植物（烟草、水稻、卷心菜和杨树等）和动物细胞（中国仓鼠卵母细胞和斑马鱼）。近几年来的研究结果显示，VHb的应用主要体现在3个方面：一是VHb提高微生物代谢产物的产量；二是对动植物某些特性的影响；三是增加生物修复能力。

3.1 VHb提高微生物代谢产物的产量

研究证明，通过选择合适的启动子构建含vgb基因的载体让VHb高效表达，能提高很多宿主的代谢物产量。vgb基因的天然启动子是强启动子，表达量高，启动子的活性受溶氧浓度调节，诱导条件温和，适用于一些革兰氏阴性菌。对于其他宿主就需要选择对应的启动子。例如，CaMV 35S启动子常用于真菌和高等植物。近几年，VHb运用于基因工程菌，提高有用的代谢产物产量的应用也在稳速的发展中，总结起来主要有以下4类代谢物：抗生素、聚合物、蛋白质和其他生化制剂。

3.1.1 抗生素 早在1993年DeModena等［12］就已经将vgb基因整合到Acrenmoniun chrysogenum中以提高头孢菌素C的产量。头孢菌素C的生物合成途径受碳、磷、溶解氧等的影响，其中氧尤为重要，因为头孢菌素C的生物合成途径中包括3个重要的耗氧反应：三肽环化酶反应、扩环反应和脱乙酞头孢菌素C的羟基化反应，因此头孢菌素C的发酵过程与氧有着紧密的联系。由此可见，VHb可以用于合成抗生素的发酵工艺。迄今为止，VHb蛋白已经成功的运用于很多细菌或真菌来提高抗生素的产量。例如，VHb能提高糖多孢菌的红霉素产量；提高地中海拟无枝菌酸菌的利福平b产量；提高天蓝色链霉菌中Actinorbodin产量等［13，14］。

近5年来，VHb在提高抗生素产量上的应用越来越多，详见表2。VHb在宿主菌雪白弯颈霉中的表达使环孢菌素产量提高33.5%；在顶头孢霉中使头孢菌素产量提高27%［15，16］。2011年，Zhu等［17］将vgb基因整合到Phellinus igniarius中，VHb蛋白的表达使宿主菌的黄酮和胞外多糖产量分别提高了78%和54%，黄酮和胞外多糖都是含有杀菌效果的化合物。2012年，Luo等［18］也将vgb基因整合到刺糖多胞菌中，VHb的表达大大提高了工程菌株的耗氧量，有利于发酵产物的生成。最近的研究报道指出，在链霉菌生产游霉素的工业生产中，VHb蛋白的表达将游霉素的产量提高了75%［19］。在发酵工业中供氧问题是需解决的最重要的问题之一，尤其是在发酵后期。而VHb蛋白在氧含量较低的情况下能结合氧并将氧传递到末端氧化酶以达到增加发酵产物的目的，这对工业生产的意义是非常重大的。

3.1.2 聚合物 VHb蛋白除了能应用到抗生素的生产中，还能用在生物大分子聚合物的合成中，详见表3。最初，研究者们发现，在产羟基丁酸和羟基乙酸盐混合聚合物的基因工程菌中表达VHb蛋白可以提高混合聚合物的产量。2006年和2007年都有研究报道指出，VHb的表达能提高木醋杆菌细菌纤维素的产量［20，21］。细菌纤维素具有很高的商业利用价值，在医药材料中可以用作人造皮肤、人造血管；在食品工业中可作为食品的成型剂、增稠剂、分散剂、抗溶化剂、改善口感等，已成为一种重要的食品基料和膳食纤维；在造纸工业中细菌纤维素可以提高纸张强度和耐用性；还可用来制作高级音响设备的振动膜，因此提高细菌纤维素的产量和质量具有重要的意义。

表2 VHb提高微生物代谢产物抗生素的产量

表3 VHb提高微生物代谢产物聚合物的产量

近几年来，越来越多的生物聚合物的产量因为VHb的参与得到提高。例如，Su等［22］将vgb基因整合到枯草芽孢杆菌基因组上，在高黏度的发酵条件下细菌量增加了1.26倍，而发酵产物聚γ谷氨酸足足增加了2.07倍。同样是发酵生产聚γ谷氨酸，Zhang等［23］在解淀粉芽孢杆菌中构建含有vgb基因的重组质粒pWHV，聚γ谷氨酸产量提高了9.56%，为了让VHb能稳定表达，将vgb基因同源重组到染色体上，细菌生物量增加7.9%，而聚γ谷氨酸产量却提高了30%。本实验室将vgb基因构建到广谱质粒pCM158上，在土壤杆菌ZX09中表达，使土壤杆菌ZX09的发酵产物索拉胶的产量提高了约30%。

3.1.3 蛋白质和其他生化制剂 VHb蛋白在微生物中的表达除了能提高抗生素和聚合物的产量，还能提高一些其他的生物分子的产量，如酶、蛋白质和其他一些有用的代谢产物，详见表4。

表4 VHb提高微生物代谢产物蛋白和生化制剂的产量

vgb基因通常是放在表达载体上转入宿主菌或是整合到宿主菌的基因组上表达，以达到改造菌种降低发酵成本的目的。以大肠杆菌为例，vgb基因的表达能将总蛋白的表达水平提高10%以上，贫氧条件下VHb的作用更为明显。VHb在大肠杆菌α-淀粉酶基因工程菌中的表达可将α-淀粉酶的产量提高3.3倍，在限氧条件下能将淀粉酶的产量提高到对照菌株的7倍左右［24，25］；在大肠杆菌含几丁质酶基因的载体上表达，能促进几丁质酶的分泌，提高几丁质酶活性，随着氧含量的降低，几丁质酶活性也随之提高［26］。

近几年用VHb来提高酶产量的主要宿主菌是毕赤酵母，酵母的表达系统更加优越，但是如果在酵母的发酵过程中遭遇贫氧环境，酵母就会改变代谢途径，大量生成乙醇，而乙醇对酵母具有明显的阻碍作用，所以vgb基因的插入就能解决这一问题。在氧受限的条件下，VHb的表达菌株的脂肪酶活性是对照菌株的1.8倍，β-半乳糖苷酶的活性比对照下降31.2%；但在氧充分时β-半乳糖苷酶的活性只提高9.9%［27，28］。

近5年来，VHb的表达提高某些其他的微生物代谢产物的例子还有很多，如L-多巴和多巴胺（产量分别增加了20倍和100倍）；二羟基丙酮（产量增加37.36%）；黄芪甲苷IV（产量是对照的5-6倍）；鼠李糖脂；紫穗槐-4，11-二烯；草酸盐等［29-34］。

3.2 VHb蛋白影响动植物的某些特性

虽然VHb蛋白是原核生物血红蛋白，但有研究表明，VHb蛋白也可以用于植物和动物，见表5。第一个将VHb蛋白用于植物的是Holmberg等［35］，将vgb基因导入烟草中发现VHb的表达明显促进了烟草的生长，提前了发芽和开花的时间，增加了叶绿素Ⅱ和尼古丁的含量，但是新烟碱的含量却比对照减少了。有报道指出VHb蛋白还能在卷心菜、苜蓿、喇叭花中表达，以增加植物的生长和抗缺氧能力。但是也有实验证明，VHb的表达对白杨树的生长，抗淹，抗氧化氮化能力的影响不稳定，所以对于植物氧代谢的基因操作比微生物复杂很多，有更多的因素需要考虑［36］。黑莨菪是一种重要的中药材，Wilhelmson等［37］将vgb基因转入黑莨菪毛状根中表达，使转基因毛状根干重增加了18%，莨菪碱平均含量提高22%，单位体积莨菪碱含量增加43%，由此看出VHb蛋白在中药领域也有一定的应用前景。

VHb蛋白在动物中的应用报道得比较少，因此应用潜力也最大。最早将VHb用于动物的是，Pendse等［38］将vgb基因融合到小鼠乳腺瘤病毒（MMTA）启动子调控的表达载体上，整合到能分泌组织纤溶酶原激活物（tPA）的中国仓鼠卵母细胞中，在限氧条件下VHb的表达使哺乳动物细胞产物增加了40%-100%。2011年Guan等［39］通过基因改造使VHb蛋白在斑马鱼中表达，以提高鱼在缺氧的环境中的生存能力。

表5 VHb促进动植物特性的改变

3.3 VHb在生物修复中的应用

透明颤菌血红蛋白除了运用到以上几个方面，还有报道指出，它能提高微生物对毒害物质的抗性和降解能力。苯类物质（苯、甲苯、二甲苯和二硝基甲苯等）是存在于水环境中的一类主要污染物，目前主要利用微生物来降解这类物质。微生物降解是通过氧化酶催化芳香环发生羟基化或烷基取代反应，氧是这些反应的重要参与者，而污水中的低氧环境对反应很不利，所以解决氧的问题是关键。

有文献报道，将vgb基因整合到铜绿假单胞菌和伯克霍尔德菌的染色体中，VHb的表达能促进重组铜绿假单胞菌降解二硝基甲苯，但对重组伯克霍尔德菌的降解能力无明显影响［40］。Patel等［41］的研究结果显示，将vgb基因克隆到广谱性质粒上再转入伯克霍尔德菌中，VHb的表达能加快其降解DNT的速度，3 d就可将初始浓度为200 μg/mL的DNT降到0。

通过共同表达有机磷水解酶（OPH）和VHb蛋白的重组大肠杆菌能够将有机磷毒物和对氧磷毒物降解为无害物质。重金属离子对细胞的毒害作用也很明显，有报道称，VHb的表达能使重组产气肠菌株对镉的吸收能力提升2倍［42］。另外，VHb蛋白在红串红球菌和德氏假单胞菌中的表达可以使柴油脱硫能力增加38%和22%，这对环境保护具有重要的意义，因为硫燃烧产生的二氧化硫是严重的环境污染物［43，44］。

4 结语

透明颤菌血红蛋白能够从分子水平上控制宿主菌对氧气的利用能力，通过基因重组的方法使透明颤菌血红蛋白在基因工程菌中表达，使得宿主菌在限氧条件下依旧能够维持高水平的细胞生长和产物合成，从而提高有价值的生物分子的产量。同时，透明颤菌血红蛋白在宿主菌中的表达可以降低氧气及能量的消耗，这就不需要再对发酵设备进行额外的投资，进而降低了发酵成本，因此透明颤菌血红蛋白的应用大大地促进了微生物发酵工业的发展。

此外，通过转基因的手段使VHb在植物体内表达，不仅可以影响植物的生长，还影响着植物与氧有关的生命活动。更重要的是，VHb的表达已经开始运用于动物细胞，这是一项很大的进步，因而具有更为广阔的发展空间。由于动植物的代谢比微生物复杂很多，所以近年来VHb在动植物领域的应用发展比较缓慢，但是未来值得期待。

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［49］Xu M， Rao Z， Xu H， et al. Enhanced production of L-arginine by expression of Vitreoscilla hemoglobin using a novel expression system in Corynebacterium crenatum［J］. Appl Biochem Biotechnol， 2011， 163（6）：707-719.

［50］Li X， Peng RH， Fan HQ， et al. Vitreoscilla hemoglobin overexpression increases submergence tolerance in cabbage［J］. Plant Cell Rep， 2005， 23（10-11）：710-715.

［51］Wang Z， Xiao Y， Chen W， et al. Functional expression of Vitreoscilla hemoglobin（VHb） in Arabidopsis relieves submergence， nitrosative， photo-oxidative stress and enhances antioxidants metabolism［J］. Plant Science， 2009， 176（1）：66-77.

（责任编辑 狄艳红）

多检测器GPC提供全面数据分析生物医药高分子材料突破点

1964年，John C. Moore出版了关于凝胶渗透色谱（GPC）的专著，从此改变了科学家研究聚合物和大分子的方式。在将近半个世纪后，关于GPC的理论、实验技术以及仪器性能均有了突飞猛进的发展，GPC也已被广泛应用于工业、农业、医药、卫生、国防等各个领域。在GPC技术未出现之前，研究人员大多采用黏度法、渗透压法和超离心沉淀等方法测量高分子聚合物的分子量，但这些方法不仅费时，而且操作繁琐，另外消耗的溶剂量也很大。随着GPC技术的问世与日渐成熟，研究人员能够在无需花费太高成本、操作简单的情况下，即可得到聚合物的相对分子量与分子结构，从而为生物医药类高分子和合成高分子材料的开发提供有力支持。

上海交通大学（以下简称交通大学）早在20世纪80年代就启动了对生物医药类高分子和合成高分子的研究。在研究初期，多采用传统GPC系统进行高分子和合成高分子的检测，该系统只包含示差RI或紫外UV两种检测器，有较好的精度和重现性，能够帮助科研人员得到相对分子量信息。但随着研究的一步步深入，要准确描绘出有助于精确控制聚合物性能的内部结构，除了分子量，聚合物的构象、支化和聚集等结构特征也是关键参数，而这些信息光凭示差RI和紫外UV检测器是无法得出的。经过前期的试验测试和专家研究论证，交通大学最后选择了马尔文的四重检测器GPC系统。该系统除了示差、黏度和PDA紫外检测器，还包括马尔文最新推出的拥有20个检测角度的ViscotekSEC-MALS20多角度光散射检测器。这些检测器被集成在一个色谱温度控制系统中，在一次测试过程中可以同时收集所有检测器信号，提供所检测高分子的绝对分子量Mw、Mn、Mz、分子量分布、高分子的特性黏度IV、高分子的Mark-Houwink曲线、高分子线团的大小以及共聚物的组分信息，极大地丰富了表征手段，为科研工作提供有力的数据支持。

当前，在大多数聚合物的开发项目中，多检测器GPC系统备受青睐。多检测器的组合优势可以将实验效率最大化，使研究人员在短时间内就能够获取关于聚合物结构的全面信息。

（信息来源： 产业新闻社 ）

The Structure-function Relationship of Vitreoscilla Haemoglobin and Its Application in Biotechnology

Chen Yunmei Xu Haiyang Wang Shiming
（Center for Molecular Metabolism，Nanjing University of Science & Technology，Nanjing 210094）

The hemoglobin from the bacteriumVitreoscilla（VHb） is the firstmicrobial hemoglobin， which has been extensively studied with respect to its structure， biochemical functions， and the mechanisms by which itsexpression is controlled. Expressing VHb in a variety of heterologous hostsresults substantial increasesin production of a variety of useful products（antibiotics， proteins， polymersetc.）， host resistance andability to degrade some harmful compounds， by promoting oxygen transport to enhance respiratory and energy metabolism. So this paper reviewed on the function and structure of VHb and the improving output of microbial metabolites， some characteristics of plants and animals and influence of the application of bioremediation capability. And we discussed about the application prospect and development space in the metabolism of plant and animal.

Vitreoscillahemoglobin；bioproduct；production metabolite；bioreme diation；fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.007

2014-06-18

中央高校基本科研业务费专项资金（30920130121013）

陈云美，女，博士研究生，研究方向：微生物发酵工程；E-mail：yunmei7866@163.com

王世明，男，博士，副教授，研究方向：微生物代谢和酶工程；E-mail：bioeng@mail.njust.edu.cn