白杨素对实验性糖尿病大鼠心脏损害的保护作用及其机制

白杨素对实验性糖尿病大鼠心脏损害的保护作用及其机制

糖尿病心血管并发症是糖尿病患者的主要死亡原因［1］。越来越多的研究显示，高血糖诱导产生的过量自由基造成的氧化应激在糖尿病心血管并发症的发生发展中起着重要作用［2-3］。糖尿病心肌病是糖尿病性心脏病的特异性病变，其发病机制尚未完全明了。白杨素，化学名称为5，7-二羟基黄酮，是从紫葳科植物木蝴蝶中提取的一种具有广泛药理活性的黄酮类化合物，其在蜂胶中的量较高，是蜂胶的主要有效成分之一。研究证明，它具有抗感染、抗氧化、防治心脑血管疾病等多种药理作用［4-5］。本实验腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立大鼠糖尿病（DM）模型，探讨白杨素的降血糖和心脏保护作用及其机制。

1　材料与方法

1.1动物

健康清洁级SD雄性大鼠50只，体重160～180 g，由河北医科大学实验动物中心提供（动物合格证号：DK0503-0031）。

1.2试剂药品与仪器

STZ（Sigma，美国），白杨素（纯度大于98%）（大连美仑生物），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量试剂盒（武汉博士德），强生稳豪倍易型血糖仪及强生稳豪倍易型血糖试纸，酶标仪（生工生物有限公司）。

1.3糖尿病模型建立与分组

1.3.1制备糖尿病动物模型SD大鼠普通饲料喂养，饲养室温度20～25℃，通风良好，分笼适应性喂养7 d，禁食12 h后测空腹血糖，随机选取10只大鼠作为正常组，其余40只大鼠一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg（用0.1 mol/L pH=4.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制），正常组腹腔注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。于给药3 d后断尾取血测空腹血糖，选取空腹血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠模型［4］。

1.3.2分组与灌胃31只成模SD大鼠，随机分为模型组、白杨素低剂量组、白杨素高剂量组，模型组11只，低、高剂量组各组10只。成模1周后，低、高剂量组分别给予白杨素50、100mg/（kg·d），连续灌胃21 d。白杨素用0.1%羧甲基纤维素钠配制成混悬液，正常组和模型组则给予等容量的0.1%羧甲基纤维素钠。实验期间大鼠自由进食、饮水。

1.4检测指标

1.4.1血糖和体重测定断尾取血，每周定点测量各组大鼠空腹血糖（FBG）和体重。

1.4.2丙二醛含量及超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性测定给药结束时各组大鼠均禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，离心，取上清；迅速剖离心脏组织，剪取lmm3大小的心肌组织于10%中性甲醛溶液中固定切片，其余液氮速冻，-76℃冰箱保存，制备10%组织匀浆，离心，取上清。按照SOD、MDA、GSH-Px测试盒说明书检测血清和心脏组织的MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

1.4.3心脏组织HE染色将用10%中性甲醛固定的心脏组织切成4μm厚的切片，切片常规脱蜡至水，苏木精染细胞核，伊红染细胞质，梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。镜下观察心肌细胞形态。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　白杨素对实验性糖尿病大鼠体重的影响（g，±s）

表1　白杨素对实验性糖尿病大鼠体重的影响（g，±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与白杨素低剂量组比较，ΔP＜0.05；动物只数不包含剔除

组别只数造模前给药前给药后7 d 14 d 21 d正常组模型组白杨素低剂量组白杨素高剂量组10 991 0 190.6±11.7 190.4±15.2 191.9±10.1 191.6±11.7 200.7±15.2 183.0±11.6**184.9±8.4 185.1±9.6 214.4±15.9 169.0±11.3**168.6±6.3 178.9±10.6 224.0±18.5 157.9±8.5**159.4±6.5 174.8±10.6#Δ231.0±19.1 150.1±10.3**156.3±11.5 167.9±9.2#

表2　白杨素对实验性糖尿病大鼠空腹血糖的影响（mmol/L，±s）

表2　白杨素对实验性糖尿病大鼠空腹血糖的影响（mmol/L，±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01，与白杨素低剂量组比较，ΔΔP＜0.01；动物只数不包含剔除

组别只数造模前给药前给药后7 d 14 d 21 d正常组模型组白杨素低剂量组白杨素高剂量组10 991 0 5.1±0.3 5.3±0.7 5.4±0.4 5.2±0.5 5.3±0.6 30.2±3.1**30.8±2.3 30.9±2.5 5.2±0.8 32.4±2.3**29.4±2.0##28.8±1.9##5.3±0.4 31.2±2.3**26.2±1.9##25.8±1.8##5.3±0.6 31.4±1.7**25.5±1.6##21.5±2.1##ΔΔ

2　结果

2.1白杨素对实验性糖尿病大鼠体重、空腹血糖的影响

一般情况：正常组大鼠皮毛光泽，反应敏捷，体重随着饲养逐渐增加；模型组大鼠毛发直立、光泽晦暗，反应迟钝，体重下降，可见明显多尿、多饮、多食症状；与模型组相比，白杨素低剂量组、白杨素高剂量组同样出现“三多”现象，但程度较轻，体重下降较为缓慢。

与正常组相比，模型组大鼠体重显著下降、FBG水平升高（P＜0.01）；与模型组相比，白杨素高剂量组大鼠体重明显升高（P＜0.05），FBG水平明显降低（P＜0.01）；与白杨素低剂量组相比，白杨素高剂量组大鼠体重升高（P＜0.05），FBG水平下降（P＜0.01）。见表1、2。

2.2大鼠心脏组织氧化应激指标检测

与正常组相比，模型组大鼠SOD、GSH-Px活性明显下降（P＜0.01），MDA含量明显升高（P＜0.05）；与模型组大鼠相比，白杨素低、高剂量组SOD、GSH-Px活性明显升高（P＜0.01），MDA含量下降（P＜0.05）；与白杨素低剂量组相比，白杨素高剂量组SOD、GSH-Px活性升高更明显（P＜0.01），MDA含量下降（P＜0.05）。见表3。

表3　白杨素对实验性糖尿病大鼠心脏组织MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响（±s）

表3　白杨素对实验性糖尿病大鼠心脏组织MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与白杨素低剂量组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶；动物只数不包含剔除

组别只数MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）正常组模型组白杨素低剂量组白杨素高剂量组10 991 0 0.4±0.1 0.9±0.6*0.7±0.3#0.6±0.2#Δ86.7±3.9 49.8±14.7**62.0±10.8##74.6±10.9##ΔΔ230.8±22.6 134.5±10.0**156.6±8.5##185.9±4.3##ΔΔ

2.3大鼠血清氧化应激指标检测

与正常组相比，模型组大鼠SOD、GSH-Px活性明显下降（P＜0.01），MDA含量明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，白杨素低、高剂量组SOD、GSH-Px活性明显升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量下降（P＜0.05）；与白杨素低剂量组相比，白杨素高剂量组SOD、GSH-Px活性升高更明显（P＜0.05），MDA含量下降（P＜0.05）。见表4。

表4　白杨素对实验性糖尿病大鼠血清MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响（±s）

表4　白杨素对实验性糖尿病大鼠血清MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与白杨素低剂量组比较，ΔP＜0.05；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶；动物只数不包含剔除

组别只数MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）GSH-PX（U/mg）正常组模型组低剂量组高剂量组10 777 0.8±0.1 2.8±0.1*2.6±0.1#2.3±0.2#Δ137.0±10.7 75.7±9.9**98.6±20.5#114.0±21.1##Δ1705.8±86.9 832.1±208.5**1246.6±89.8##1448.6±76.0##Δ

2.4白杨素对实验性糖尿病大鼠心脏组织形态的影响

心脏组织HE染色可见，正常组心肌细胞结构清晰，细胞之间连接紧密，排列有序；模型组心肌细胞疏松、水肿，排列紊乱，有炎症细胞浸润；白杨素低剂量组心肌细胞间隙增宽，排列较紊乱；白杨素高剂量组心肌细胞，组织间隙疏松不明显，排列较紧密，纹理较清晰。见图1。

3　讨论

黄酮类化合物是一类高药理活性的天然化合物，可以通过清除自由基，减轻脂质过氧化，调节糖脂代谢，提高机体胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗等途径降低血糖，起到防治糖尿病及其并发症的作用［4］。白杨素在植物界中分布广泛，是人类发现的第一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗感染、防治心脑血管疾病、抗肿瘤等多种药理作用［5-6］。

图1　白杨素对实验性糖尿病大鼠心肌形态学的影响（HE，400×）

糖尿病心肌病是糖尿病最常见的心血管并发症之一，是独立于冠状动脉病变、微血管病变和自主神经病变之外的心肌结构改变和功能失调［7］。在病理上主要表现为心肌细胞肥大、局灶性坏死、细胞外基质堆积、间质纤维化［8］。利用STZ一次性腹腔注射诱发大鼠糖尿病是目前国内外使用较多的也较为可靠的一种糖尿病动物模型制备方法［9］。本实验成功建模后动物空腹血糖值≥16.7 mmol/L，出现体重下降和多饮、多尿、多食症状。心脏组织形态观察发现，心肌细胞疏松、水肿，细胞间隙增宽，排列紊乱，有炎症细胞浸润，未见典型的心肌细胞肥大、局灶性坏死。可能与早期糖尿病模型观察时间短（4周）有关。尽管未见典型性糖尿病心肌病结构表现，但已经提示糖尿病早期即可引发一定程度的心脏损害。研究显示，及时给予白杨素可降低糖尿病大鼠空腹血糖，改善“三多一少”症状，一定程度上避免心肌损伤。

糖尿病时，高糖环境促使ROS生成增加，ROS可通过多元醇途径、蛋白激酶C（PKC）途径、糖基化终末产物（AGEs）途径和氨基己糖途径等引发糖尿病并发症。另外，高血糖还可以导致抗氧化酶的糖基化，使机体抗氧化酶活性降低，导致氧化与抗氧化系统失衡，清除自由基的能力降低［10-11］，这些因素均可引起心肌组织的严重损伤。研究发现，ROS参与了糖尿病心肌病的发病，在血液中和心肌中均发现氧化应激物的存在［12］。自由基造成对机体组织损伤的程度主要与脂质过氧化物MDA含量及抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px等）活性变化有关［13-14］。本研究糖尿病大鼠血清和心肌组织检测显示，MDA含量增加及抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性降低，白杨素可增加糖尿病大鼠血液及心脏组织的GSH-Px、SOD活性，降低MDA水平。表明白杨素对糖尿病大鼠心脏保护作用可能与其抗氧化作用有关。另外有研究表明，白杨素有一定的醛糖还原酶抑制作用［15］。多元醇代谢活性亢进为糖尿病并发症的成因之一，糖尿病发生时醛糖还原酶作为多元醇通路的限速酶被激活，导致细胞代谢与功能的损害，参与糖尿病并发症的发生发展［11］。白杨素的醛糖还原酶抑制作用是否参与糖尿病心肌病的保护有待进一步研究。

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李倩陈敏李洁欣李洁张轩萍
山西医科大学药理教研组，山西太原030001

目的观察白杨素对实验性糖尿病大鼠心脏损害的保护作用，探讨其保护机制。方法一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）溶液建立大鼠实验性糖尿病模型。成模大鼠随机分为模型组、白杨素低剂量组［灌胃，50mg/（kg·d）］和白杨素高剂量组［灌胃，100mg/（kg·d）］。每周定点测量各组体重和空腹血糖，3周后禁食12 h麻醉大鼠，取血和心脏组织，测定其丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。HE染色观察心脏组织形态学变化。结果与模型组相比，白杨素低、高剂量组大鼠血糖显著降低，血清和心脏组织SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量下降（P＜0.05），心脏损伤程度明显减轻。结论白杨素对实验性糖尿病大鼠的心脏损害有一定保护作用，可能与其抗氧化作用相关。

白杨素；糖尿病；氧化应激；心脏损害

Thecardiaprotection andmechanism of chrysin for exprimentaldiabetic rats

LIQian CHEN Min LIJiexin LIJie ZHANG Xuanping
Department of Pharmacology，ShanxiMedical University，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China

Objective To investigate the cardiaprotection of chrysin for exprimental diabetic rats and its related mechanism.M ethods Streptozotocin（STZ）was given to induce the diabetic ratsmodel.Themodel rats were divided into themodel group，chrysin low dose group［ig，50 mg/（kg·d）］and chrysin high dose group［ig，100 mg/（kg·d）］.Rats weight and fasting blood glucose（FBG）were detected weekly.After 3 weeks，rats were given anesthesia after 12 h ambrosia，blood and cardiac tissue were obtained.The concentration of malondialdehyde（MDA），the activity of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in serum and myocardium were measured.The morphology changes of heart tissue was observed with HE staining.Results Compared with the model group，in the chrysin low dose group and the chrysin high dose group，the FBG level decreased，the activities of SOD and GSH-Px increased，MDA contentdecreased，with statistically significant differences（P＜0.05）.Conclusion Chrysin treatment has a protective effect on myocardial injury in diabetic rats，whichmay be related to antioxidant effect．

Chrysin；Diabetesmellitus；Oxidative stress；Heart damage

R285.5

A

1673-7210（2015）05（a）-0015-04

2014-12-04本文编辑：程铭）

山西省自然科学基金（2011011034-3）；山西医科大学青年基金资助项目（Q02201206）。

李倩（1989-），女，山西长治人，山西医科大学2012级药理学专业在读硕士研究生；研究方向：心血管药理学。

李洁（1972-），女，山西太原人，博士，副教授，硕士研究生导师；研究方向：心血管药理学。张轩萍（1969-），女，山西运城人，博士，教授，硕士研究生导师；研究方向：心血管药理学。