番茄植株总黄酮提取工艺优化

邸娜，韩海军，郑喜清，王靖，李亚珍，*，张瑞萍

（1.河套学院农学系，内蒙古巴彦淖尔015000；2.巴彦淖尔市农牧业技术推广中心，内蒙古巴彦淖尔015000）

番茄植株总黄酮提取工艺优化

邸娜1，韩海军2，郑喜清1，王靖1，李亚珍1，*，张瑞萍1

（1.河套学院农学系，内蒙古巴彦淖尔015000；2.巴彦淖尔市农牧业技术推广中心，内蒙古巴彦淖尔015000）

以番茄植株为植物材料，研究乙醇浸提法提取其总黄酮的最佳工艺条件。以番茄植株总黄酮的提取量为考察指标，通过单因素试验和正交试验研究乙醇浓度、浸提时间、料液比和浸提温度对番茄植株总黄酮提取量的影响程度及最佳提取工艺条件。结果表明，上述四因素对番茄植株总黄酮提取量影响的大小顺序依次为乙醇浓度＞浸提温度＞料液比＞浸提时间；最佳提取工艺条件为：60%乙醇，料液比30 mL/g，70℃条件下，浸提1.5 h；最高提取量为0.408 mg/g。

番茄植株；黄酮；乙醇浸提

黄酮类化合物是一类低分子量的天然物质，是植物体内的次级代谢产物，广泛的分布于多种植物体内［1］。研究表明黄酮类化合物具有清除生物体内的自由基、抗肿瘤、抗衰老、抗心血管疾病等作用，且无毒无害［2-3］，在食品、药品、保健品等方面得到广泛应用。因此，从植物体内，提取天然的高纯度黄酮类化合物受到了国内外学者的广泛关注，但目前尚未见番茄植株中黄酮类化合物提取工艺的相关报道。本文以番茄植株为植物材料，采取传统的乙醇浸提法，在单因素试验的基础上，采取正交试验的方法优化提取工艺，以其为工业化生产黄酮类化合物提供适宜的工艺参数，同时也为番茄植株的再利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

番茄植株：巴彦淖尔市临河区气象局试验田；芦丁标准品为生物级；无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等试剂为分析纯，水为超纯水。

分光光度计（723型）凤凰；分析天平（BSA323SCW）赛多利斯；水浴锅（HH-4）常州博远。

1.2试验方法

1.2.1番茄植株预处理方法

选择结果期的番茄植株自来水清洗干净后剪成5 cm左右的小段，于50℃恒温干燥箱内烘干，粉碎后过60目筛，所得样品储存于干燥避光处备用。

1.2.2番茄植株总黄酮的提取

准确称取1.000 g备用的番茄植株粉，乙醇浸提，4 000 r/min离心2 min，收集三次滤液于50 mL容量瓶中，乙醇定容，作为样品浸提液。

1.2.3芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品20 mg，60%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，得0.4 mg/mL芦丁标准溶液。精确吸取芦丁标准溶液0、1、2、3、4、5 mL分别置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液至12.5 mL，混匀；分别加5%的NaNO20.75mL，摇匀静置6min；再各加10%Al（NO3）30.75 mL，摇匀静置6 min；再分别加入4%NaOH 10 mL，摇匀；最后用60%乙醇溶液定容至25mL，静置10min，510 nm处测其吸光度值。

1.2.4样品浸提液总黄酮的测定

准确吸取样品浸提液10 mL于25 mL容量瓶中，用亚硝酸钠-硝酸铝显色法使其显色，于510 nm处测定其吸光度值，根据标准曲线计算总黄酮的提取量。

1.2.5单因素试验

选取乙醇浓度、料液比、浸提温度、浸提时间4个因素，以浸提液的总黄酮含量为判断标准，确定各因素的适宜范围，具体因素组合见表1。

表1　单因素试验因素水平Table 1Factors and levels of single factor experiment

1.2.6正交试验

在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、料液比、浸提温度和浸提时间为主要因素，按照表2进行L9（34）正交试验设计，对番茄植株中的总黄酮进行提取，以总黄酮的含量为判断依据，确定以上四因素的优化组合。

表2　正交试验因素水平Table 2Factors and levels of orthogonal experiment

2　结果与分析

2.1标准曲线及回归方程

按照1.2.3的方法，以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程为：y=11.863x+ 0.003 3，R=0.999 8，标准曲线见图1。

图1　芦丁标准曲线Fig.1Standard curve of rutin

实验表明在0.00 mg/mL～0.08 mg/mL范围内，芦丁浓度与吸光度值呈良好线性关系。

2.2番茄植株浸提液与芦丁标准品吸收光谱比较

番茄植株浸提液和芦丁标准品用亚硝酸钠-硝酸铝显色法显色后，在400 nm～650 nm下扫描二者的吸收光谱，扫描结果见图2。

图2　芦丁与样品NaNO2-Al（NO3）3显色后的吸收光谱Fig.2Absorption spectrum of rutin and sample with NaNO2-Al（NO3）3

结果表明芦丁标准品和番茄植株浸提液分别在508 nm和510 nm处有最大吸收峰，且二者的吸收光谱特征相似，说明番茄植株总黄酮的提取和定量方案合理可行。

2.3单因素试验

2.3.1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

乙醇浓度对总黄酮提取率的影响见图3。

图3　乙醇浓度对黄酮提取率的影响Fig.3The effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

结果表明乙醇浓度对番茄植株总黄酮的提取率有较大影响。当乙醇浓度由40%增大到60%时，总黄酮提取率急剧增加，由60%增大到70%时，提取率增加幅度减缓，当乙醇浓度为70%时总黄酮提取率达到最大，再增大乙醇浓度，总黄酮提取率迅速降低。这可能是由于番茄植株中黄酮类化合物种类较多，不同种类的黄酮类化合物物理性质不同，即有些为醇溶性的，有些为水溶性的［4］，随着乙醇浓度的增加，水溶性的黄酮类化合物浸出率逐渐下降，醇溶性黄酮类化合物的浸出率逐渐升高，与此同时醇溶性的其他物质也大量溶出，当乙醇浓度过高时，可明显观察到浸提液的颜色由棕黄色变为绿色，而总黄酮的提取率也迅速下降，说明叶绿素的大量溶出阻碍了黄酮类化合物的溶出。因此只有适宜的乙醇浓度才能同时溶出醇溶性和水溶性的黄酮类化合物，又能使其他醇溶性化合物，如叶绿色的影响降到较小的程度。

2.3.2料液比对总黄酮提取率的影响

料液比对总黄酮提取率影响的结果如图4所示。

图4　料液比对黄酮提取率的影响Fig.4The effect of solid liquid ratio on extraction rate of flavonoids

在10 mL/g～40 mL/g的范围内，总黄酮的提取率随料液比的增加逐渐增大，达到40 mL/g时总黄酮的提取率达到最大，以后趋于稳定。原因在于料液比越大，溶剂与细胞间的总黄酮的浓度差越大，越有利于黄酮类化合物的溶出。但当溶剂用量增大到一定程度时，溶剂中与细胞间黄酮类物质的溶出达到动态平衡，即使再增大溶剂用量，总黄酮的溶出量也不会增加。2.3.3浸提温度对总黄酮提取率的影响

浸提温度对总黄酮提取率的影响见图5。

图5　浸提温度对黄酮提取率的影响Fig.5The effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

50℃～70℃范围内，随着温度的升高总黄酮的提取率明显提高，但是当温度超过70℃时，随着温度的升高，总黄酮的提取率迅速下降。这是由于随着温度的升高，溶剂的渗透能力逐渐增强，黄酮的浸提率有所升高，但当温度超过70℃时，乙醇挥发导致溶剂的浓度下降，浸提率相应降低，而且部分黄酮可能随着温度的升高发生分解或转化，因此70℃为黄酮浸提的适宜温度。

2.3.4浸提时间对总黄酮提取率的影响

浸提时间不同对总黄酮的提取率也有一定的影响，影响结果如图6所示。

图6　浸提时间对黄酮提取率的影响Fig.6The effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

当浸提时间为1 h～2 h时，黄酮类化合物的提取率明显增加，2 h时达到最大，超过2 h后提取率下降较快，这可能是由于长时间在高温下浸提使黄酮类化合物发生转化或分解造成的。

2.4正交试验

正交试验结果如表3所示。

测定的4个因素对番茄植株黄酮类化合物提取率的影响由大到小顺序依次为乙醇浓度＞浸提温度＞料液比＞浸提时间。从表4的方差分析结果来看，乙醇浓度、浸提温度、料液比对番茄植株黄酮类化合物的提取率具有极显著的影响，浸提时间对番茄植株黄酮类化合物的提取率具有显著影响。但对单因素检验的结果显示，当乙醇浓度为60%和70%以及料液比为30 mL/g和50 mL/g时，对番茄植株黄酮类化合物提取率的影响差异不大，为节省提取成本，综合考虑分析结果可确定番茄植株黄酮类化合物的最佳提取工艺为A2B1C1D2，即乙醇浓度为60%，料液比为30 mL/g，浸提温度为70℃，浸提时间为1.5 h。

表3　正交试验结果Table 3The results of orthogonal experiment

表4　正交试验方差分析结果Table 4The analysis of variance

2.5提取工艺验证结果

为了确认上述优化组合条件A2B1C1D2的稳定性和可靠性，进行了优化组合的验证试验，即称取番茄植株粉末1.0 g，用料液比为30 mL/g的60%乙醇溶液，在70℃条件下，浸提1.5 h，重复3次，测定黄酮类化合物的含量分别为0.409、0.403、0.412 mg/g，均值为0.408 mg/g，RSD为1.12%。结果表明此工艺条件下提取的番茄植株黄酮类化合物的含量均高于正交试验中任一组合的提取量，说明提取工艺稳定可靠。

3　讨论与结论

黄酮类化合物由于具有广泛的生理和药理作用，近年来被广泛的用于食品、药品和保健品的生产。本试验之所以采用番茄植株作为植物材料，最主要的原因在于巴彦淖尔市近年来加工型番茄的种植面积逐年扩大，已经成为我国继新疆之后的第二大加工型番茄生产基地。每年番茄采收后，大量的番茄植株被废弃，既浪费资源又污染环境。番茄植株中含有丰富的维生素C和黄酮类化合物［5］，通过试验确定黄酮类化合物的最佳提取工艺，既可以得到大量天然的黄酮类化合物，又可以解决番茄植株的再利用问题。

通过单因素试验和正交试验的结果分析来看，采用传统的乙醇浸提法提取番茄植株中的黄酮类化合物，乙醇的浓度对提取量影响最大，其他3个因素的影响力顺序依次为浸提温度、料液比和浸提时间。通过试验可确定其最佳提取工艺为60%乙醇，料液比30 mL/g，70℃条件下，浸提1.5 h。在此条件下提取结果期番茄茎中的总黄酮，提取量为0.408 mg/g（40.8 mg/ 100 g），这一结果与赵海清等［5］测定的成熟期番茄茎的总黄酮含量（35.4 mg/100 g）很接近，说明提取方法有效、可靠，这为番茄植株的再利用，变废为宝，增加农民收入提供了一个思路。

［1］钱俊臻.黄酮类化合物提取方法的研究进展［J］.化工文摘，2008（6）：35-38

［2］王慧.黄酮类化合物生物活性的研究进展［J］.食品与药品，2012，12（9）：347-350

［3］张德权，台建祥，付勤.生物类黄酮的研究及应用概况［J］.食品与发酵工业，1999，25（6）：52-57

［4］刘成梅，游海.天然产物有效成分的分离与应用［M］.北京：化学工业出版社，2003：170-236

［5］赵海清，窦君，阿吉艾克拜尔·艾萨.番茄有效成分含量测定及其综合利用产业化构想［J］.安徽农业科学，2010，38（29）：16186-16187

Optimizing Extraction Technology of Total Flavones from Tomato Plants

DI Na1，HAN Hai-jun2，ZHENG Xi-qing1，WANG Jing1，LI Ya-zhen1，*，ZHANG Rui-ping1
（1.Agriculture Department，Hetao College，Bayannaoer 015000，Inner Mongolia，China；2.Agrotechnical Promotion Center of Bayannaoer，Bayannaoer 015000，Inner Mongolia，China）

To explore the optimal condition of alcohol leaching process for total flavonoids from tomato plants. With total flavones yield as selection standard，to research the optimal extraction condition and the impact of ethanol concentration，extraction time，extraction temperature and solid/liquid on total flavonoids yield of tomato plants by single factor and orthogonal experiments.The results showed the order of the impact of above four factors on total flavones yield was ethanol concentration＞extraction temperature＞solid/liquid＞extraction time；the optimal extraction condition：ethanol concentration was 60%，solid/liquid was 30 mL/g，extraction temperature was 70℃，extraction time was 1.5 h；the highest total flavonoids yield was 0.408 mg/g.

tomato plants；flavonoid；alcohol leaching process

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.017

2014-11-18

内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZC13388）

邸娜（1983—），女（汉），讲师，硕士，从事植物栽培生理及天然产物的提取和分离方面的教学和课研工作。

李亚珍（1962—），教授，学士。