HPLC同时测定多种食品添加剂的不确定度评定

马丽，代科，曾婷，黄仕稳，鞠鹤鹏

（广州军区疾病预防控制中心，广东广州510507）

HPLC同时测定多种食品添加剂的不确定度评定

马丽，代科，曾婷*，黄仕稳，鞠鹤鹏

（广州军区疾病预防控制中心，广东广州510507）

建立高效液相色谱（HPLC）法测定灌装红腰豆中苯甲酸、山梨酸、糖精钠含量的不确定度方法。通过建立数学模型，确定影响不确定度的因素，分析各不确定度对实验结果的影响。样品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠含量测定的合成标准不确定度分别为0.028 7、0.017 3、0.127 9 mg/kg，扩展不确定度分别为0.057 4、0.034 7、0.255 8 mg/kg。本研究方法可为HPLC法测定灌装红腰豆中苯甲酸、山梨酸、糖精钠含量的不确定度评估提供参考。

HPLC；测量不确定度；食品添加剂；合成标准不确定度；扩展不确定度

近年来，以防腐剂、甜味剂以及香精为代表的食品添加剂已经被大量的运用到食品生产加工和方便食品当中［1］。因此在中国，这些食品添加剂被食品安全标准限制，这对于食品检验工作提出了较高的要求，尤其对于这些含量较低的物质，检测结果的真实性更是至关重要，测量不确定度能很好的反映测量结果的质量，因此对于不确定的研究具有一定意义。

我国于1999年制定了中华人民共和国计量技术规范JJF1059—99《测量不确定度评定与表示》［2］。根据国际通用计量学基本术语，测量不确定度的定义为：表征合理地赋予被测量之值的分散性与测量结果相联系的参数［3］。在实验测量结果中，由于测量误差的存在，而对被测量值不能确定的程度，表示误差可能存在的范围，表征结果的可信赖程度，它能更加准确的体现测量结果的分散性。

本研究根据国标GB/T 23495-2009［4］《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定（HPLC）》相关要求和方法，对测量过程中可能影响测量结果的因素进行不确定度评价和分析。

1材料和方法

1.1仪器与试剂

Waterse2695HPLC：美国Waters公司；Waters2998二极管阵列检测器，Empower software色谱工作站；AB204-L万分之一电子天平：METTLER TOLEDO；FJ-200高速分散均质机：上海标本模型厂；SIGMA 3K15离心机：德国；KQ-600型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

苯甲酸钠、山梨酸钾、糖精钠；乙酸锌、乙酸铵、亚铁氰化钾均为分析纯；甲醇为色谱纯。

1.2色谱条件

色谱柱：XBridge C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：甲醇+乙酸铵溶液（0.02 mol/L）=15∶85，乙酸铵溶液：称取1.56 g标准品，用纯水定容至1 000 mL；流速：1 mL/min；检测波长：230 nm；进样量：10 μL。

1.3溶液的配制

1.3.1标准溶液的配制

1.3.1.1苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准储备液配制

准确称取苯甲酸钠0.236 0 g、山梨酸钾0.268 0 g、糖精钠0.170 2 g，分别加水溶解并定容至200 mL。所得标准储备液浓度均为1 mg/mL。

1.3.1.2苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准稀释液配制

各取苯甲酸、山梨酸标准储备液1 mL于2个100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，两种溶液每毫升相当于含标准品10 μg。另取糖精钠标准储备液1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度。此溶液每毫升相当于含糖精钠100 μg。

1.3.1.3单标的配置

分别吸取苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准稀释液各1.0 mL于3个25 mL容量瓶中，定容至刻度，3种单标溶液的浓度分别为苯甲酸0.4 μg/mL、山梨酸0.4μg/mL、糖精钠4.0 μg/mL。

1.3.1.4混合标准使用液的配置

准确吸取不同体积的苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准稀释液于6个10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，配置成苯甲酸、山梨酸浓度分别为0.02、0.30、0.40、0.50、0.80、1.00 μg/mL，糖精钠浓度为2.00、3.00、4.00、5.00、8.00、10.0 μg/mL的混合标准溶液。

1.3.2样品的处理

1.3.2.1样品制备及预处理

取灌装红腰豆作为检验样品，将样品捣碎，再经高速组织均质机均质备用。

1.3.2.2样品前处理方法

准确称取2.500 g上述预处理好的样品于小烧杯中，用20 mL水分数次清洗小烧杯将样品移入25 mL容量瓶中，超声震荡提取5 min，取出过后加入2 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2 mL乙酸锌溶液，摇匀，用水定容至刻度。移入离心管中，4000r/min离心5min，吸出上清液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液待上机分析。

1.4测定方法

仪器打开预热，按实验条件平衡30 min以上，待基线平稳后，样品依次进样，以其单标液峰保留时间为依据定性，记录各峰面积值。

1.5测定结果

单标溶液结果苯甲酸、山梨酸、糖精钠峰保留时间分别为6.502、8.338、7.341 min。

2数学模型与不确定度计算公式

2.1数学模型

2.1.1工作曲线

苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准曲线分别为y= 5 323.0x+1 485.8（R2=0.999 956）、y=96 297.7 x-754.1（R2=0.999 981）、y=4 078.0 x-2 314.7（R2=0.999 915）。

2.1.2样品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠计算公式

式中：X为样品中待测组分含量，（g/kg）；c为由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，（mg/mL）；V为样品定容体积，mL；m为样品质量，g。

2.1.3样品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠计算结果

由标准曲线可得出：①样品溶液中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的浓度分别为0.254、0.214、1.64 μg/mL；②加标样品溶液中苯甲酸、山梨酸、糖精钠浓度分别为0.641、0.600、5.37 μg/mL；③定容体积为25 mL，样品质量为2.5 g，因此可得知样品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量分别为2.54、2.14、16.4 mg/kg。

2.2测量相对不确定度计算公式［6］

式中：u（c，rel）为样品中苯甲酸/山梨酸/糖精钠浓度的相对不确定度；urel（1）为苯甲酸/山梨酸/糖精钠标准溶液及配制引起的相对不确定度；urel（2）为标准溶液的浓度-峰面积值拟合的工作曲线求苯甲酸/山梨酸/糖精钠含量时产生的相对不确定度；urel（3）为重复测定样品产生的相对不确定度，即A类不确定度；urel（4）为试样称量引入的相对不确定度；urel（5）为样品溶液定容体积引入的相对度；urel（6）为加标回收率引起的相对不确定度。

3测量相对不确定度各分量的计算

3.1标准溶液配制引起的相对不确定度（以苯甲酸0.5μg/mL、山梨酸0.5μg/mL、糖精钠5.0μg/mL配制为例）urel（1）由以下6个分量组成。

3.1.1标准品称量引起的相对不确定度urel，w（标）

主要包括标准品纯度、天平称量示值以及天平称量重复性引起的不确定度［5］。

3.1.1.1标准品纯度引入的不确定度uw（标a）

苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准品的纯度分别为：99.0%、99.8%、99.9%，假定分布区间为0.05%，取K=，则相对不确定度：苯甲酸=0.000 29，山梨酸= 0.000 29，糖精钠=0.000 29。

3.1.1.2天平称量准确性引起的不确定度uw（标b）

AB204-L电子天平，检定证书给出的最大允差为0.000 2 g，假设为均匀分布，则u（标b）=0.000 2/31/2= 0.000 115 g。

3.1.1.3天平称量重复性的不确定度uw（标c）

AB204-L电子天平，检定证书给出的重复性误差为±0.001 1 g，假设为均匀分布，则uw（标c）=0.001 1/31/2= 0.000 635 g。

3.1.1.4天平称量引起的相对不确定度

uw（标）=［（uw（标a））2+（uw（标b））2+（uw（标c））2］1/2，则苯甲酸、山梨酸、糖精钠称量引起的相对标准不确定度分别为0.003 0、0.0026、0.00413.1.2200mL量瓶（V1）的相对不确定度urel，v1（标）包括3部分：（1）量瓶体积的不确定度，根据常用玻璃量器计量检定规定［6］可知，A级200mL量瓶的允差为±0.15mL，按均匀分布换算成标准偏差为0.087 mL；（2）定容时的估读误差，用该容量瓶重复吸取蒸馏水10次，并称量计算标准偏差为0.020 mL；（3）量瓶和溶液的温度与校正时的温度不同引起的体积不确定度［7］，但是实验室环境温度大致在25℃，容量瓶的校准温度为20℃，则环境温度引起的不确定度为

以上3项合成得出

200mL量瓶（V1）的相对不确定度：urel，v1（标）=0.000 75

3.1.31mL移液管体积（V2）的相对不确定度urel，v2（标）

包括3个部分：（1）移液管体积的不确定度，根据常用玻璃量器计量检定规定可知，A级1 mL移液管的允差为±0.007 mL，按均匀分布换算成标准偏差为；（2）吸取溶液时读数误差，估计为±0.005 mL，按均匀分布换算成标准偏差为0.005/；（3）移液管和溶液温度与校正时温度不同引起的体积不确定度为（实际温差为5℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃），移液管因环境温度校正不同引起的体积不确定度为61 mL。

以上3项合成得出：

1mL移液管（V2）的相对不确定度：urel，v2（标）=0.0050 3.1.4100 mL（糖精钠为10 mL）容量瓶体（V3）的相对不确定度urel，v3（标）

按100mL计算，包括3部分：（1）量瓶体积的不确定度，根据常用玻璃量器计量检定规定可知，A级100 mL量瓶的允差为±0.10 mL，按均匀分布换算成标准偏差为；（2）定容时的估读误差，用该容量瓶重复吸取蒸馏水10次，并称量计算标准偏差为0.018 mL；（3）量瓶和溶液的温度与校正时的温度不同引起的体积不确定度为100×2.1×10-4×5/

以上3项合成得出：

100mL量瓶（V3）的相对不确定度：urel，v3（标）=0.000 86 3.1.51 mL移液管吸取标准稀释液的体积（V4）的相对不确定度urel，v4（标）

如“4.1.3”计算，urel，v4（标）=0.005 0。

3.1.610mL容量瓶的体积（V5）的不确定度urel，v5（标）

包括3部分：（1）量瓶体积的不确定度，根据常用玻璃量器计量检定规定可知，A级10 mL量瓶的允差为±0.02 mL，按均匀分布换算成标准偏差为0.012 mL；（2）定容时的估读误差，用该容量瓶重复吸取蒸馏水10次，并称量计算标准偏差为0.006 mL；（3）量瓶和溶液的温度与校正时的温度不同引起的体积不确定度为

以上3项合成得出：

10mL量瓶（V5）的相对不确定度：urel，v5（标）=0.001 5

综上所述，

苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准溶液及配制引起的相对不确定度分别为0.007 9、0.007 8、0.006 9

3.2苯甲酸/山梨酸/糖精钠标准工作曲线拟合引起的不确定度

工作曲线数据表如表1、表2、表3所示。

urel（1）计算公式表示为：

表1　苯甲酸浓度的不确定度工作曲线数据Table 1Benzoic acid concentration of working curve data uncertainty

表2　山梨酸浓度的不确定度工作曲线数据Table 2The uncertainty of sorbic acid concentration in the working curve data

式中：n为测试标准溶液次数，n=6×3=18；P为测试样品溶液次数，P=7为各标准溶液浓度的平均值，x苯=0.533，x山=0.533，x糖=5.33；x′为样品溶液浓度的平均值；b为工作曲线的斜率，b苯=5323.0，b山=96 297.7，b糖=4 078.0。

表3　糖精钠浓度的不确定度工作曲线数据Table 3The uncertainty of saccharin sodium concentration in the working curve data

7次测量所得样品中苯甲酸浓度分别为：0.254、0.255、0.252、0.254、0.257、0.255、0.254 μg/mL，平均浓度为0.254 μg/mL；山梨酸浓度均为0.214 μg/mL，平均浓度为0.214 μg/mL；糖精钠浓度分别为1.642、1.644、1.635、1.637、1.637、1.640、1.643、1.640 μg/mL，平均浓度为1.640 μg/mL。

样品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量为x苯= 0.254×25/2.5=2.54 mg/kg；x山=0.214×25/2.5=2.14 mg/kg；x糖=1.640×25/2.5=16.40 mg/kg。

3.3高效液相色谱仪测量重复性引起的不确定度（即A类不确定度urel（3））即重复测定样品产生的相对不确定度数据见“1.5.3”项。单次测量相对不确定度

则苯甲酸、山梨酸、糖精钠单次测量引起的不确定度分别为0.002 1、0.000 30、0.000 81

3.4样品称量引入的相对不确定度urel（4）

主要由电子天平称量准确性引起的不确定度uw（标b）和称量重复性的不确定度uw（标c），分别按“4.2.1.2”和“4.2.1.3”计算，则urel（4）=0.000 26

3.5样品溶液定容体积引入的不确定度urel（5）

本次试验样品溶液定容采用的是25 mL容量瓶，25 mL容量瓶的相对不确定度urel（5）主要包括三个部分：①容量瓶体积的不确定度u（5）1，根据JJG196-2006计量检定规程，25 mL量瓶允许误差为±0.03 mL，按三角分布，则；②容量瓶重复性引入的不确定度u（5）2：属A类不确定度，由实验数据统计得u（5）1=0.021mL；③容量瓶因温度不同产生的不确定度u（5）3，在空调条件下，设室温为（25±2）℃，溶剂水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，按照矩形分布，包含因子，则环境温度引入的不确定度为u（5）3=0.006 1。

合成以上三项得

3.6回收率产生的相对标准不确定度urel（6）［8］：

3.6.1苯甲酸回收率测得的结果：为95.99%、95.92%、97.41%、97.29%、95.99%、96.11%、97.07%，平均回收率为96.54%。回收率产生的不确定度为u（6）l=，回收率相对标准不确定度为=u（6）l/P%=0.007 1。

3.6.2山梨酸为96.46%、96.72%、96.45%、96.72%、96.60%、96.54%、96.48%，平均回收率为96.57%。回收率产生的不确定度u（6）l=0.001 2，回收率相对标准不确定度为=u（6）l/P%=0.001 2。

3.6.3糖精钠为93.00%、93.08%、93.15%、93.36%、93.28%、92.99%、93.29%，平均回收率为93.16%。回收率产生的不确定度=0.0015，回收率相对标准不确定度为=u（6）l/P%=0.0016。

4苯甲酸/山梨酸/糖精钠相对合成标准不确定度

苯甲酸、山梨酸、糖精钠相对合成标准不确定度分别为0.011 3、0.008 1、0.007 8

5扩展不确定度分析

合成标准不确定度u（c）=u（c，rel）×，u（c）l=0.0113×2.54= 0.028 7 mg/kg；u（c）l=0.008 1×2.14=0.017 3 mg/kg；u（c）l=0.007 8×16.40=0.127 9 mg/kg

取置信概率P=95%，则置信区间K=2，扩展不确定度U=u（c）×K=u（c，rel）×x×K，U苯=0.011 3×2.54×2= 0.057 4 mg/kg；U山=0.008 1×2.14×2=0.034 7 mg/kg；U糖=0.007 8×16.40×2=0.255 8 mg/kg

6结论

1）影响本实验测量结果的主要因素为标准溶液的配制、标准曲线以及回收率，其中标准溶液的配制影响最大，而在这一过程中标准品的称量和移液管移取溶液所占比重最大。

2）本试验同时评定同一样品的3种成分含量测定结果的不确定度，从试验结果分析，糖精钠的测量不确定度较大，苯甲酸、山梨酸次之，最大的影响因素是标准溶液的配制。

［1］Bergamo，A B，Fracassi，J A，Jesus，D P.Simultaneous determination of aspartame，cyclamate，saccharin and acesulfame-K in soft drinks and tabletop sweetener formulations by capillary electrophoresis with capacitively coupled contactless conductivity detection［J］. Food Chemistry，2010，124（4）：1714-1717

［2］国家质量技术监督局.JJF1059-1999测量不确定度评定与表示［S］.北京：中国计量出版社，2000

［3］Intematioual Standards Organization.GUM：Guide to the Expresionof Uncertainty in Measurement［S］.Is0 Geneva Switzerland，1995

［4］中国标准化研究院.GB/T 23495-2009食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的测定（高效液相色谱法）［S］.北京：中国标准出版社，2009

［5］杨玳，黄舒丽.原子吸收光谱法测定鱼油中镉的不确定度评定［J］.食品与药品，2012，28（3）：128-131

［6］苗爱东，王彦宗.高效液相色谱法测定甲硝唑片中甲硝唑含量的不确定度分析［J］.解放军医药杂志，2012，24（1）：33-34

［7］国家质量技术监督局．JJGl96-2006常用玻璃量器检定规程［S］.北京：中国计量出版社，2006

［8］莫连峰，陈莹.HPLC法测定阿咖酚散含量的测量不确定度评定［J］.中国药品标准，2010，11（4）：921-922

The Evaluation of Measurement Uncertainty for Varieties of Food Additives by HPLC Synchronously

MA Li，DAI Ke，ZENG Ting*，HUANG Shi-wen，JU He-peng
（Centers for Disease Control and Prevention of Guangzhou Military Region，Guangzhou 510507，Guangdong，China）

To establish a method of uncertainty evaluation for the determination of benzoic acid，sorbic acid and soluble saccharin from the red beans by HPLC.By establishing a mathematical model to determine the factors affecting the uncertainty and the analysis of the effect of the uncertainty of the experimental results.Results showed determination of benzoic acid，sorbic acid，soluble saccharin content in the sample of the synthetic standard uncertainty were 0.028 7，0.017 3，0.127 9 mg/kg，the expanded uncertainty were 0.057 4，0.034 7，0.255 8 mg/kg.This method can be used in HPLC determination of benzoic acid，sorbic acid and soluble saccharin in the red beans of uncertainty evaluation.

HPLC；easurement ncertainty；food additives；synthetic standard uncertainty；expanded uncertainty

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.008

2013-12-12

马丽（1971—），女（汉），高级工程师，本科，从事食品理化检验工作。

曾婷，硕士研究生，助理研究员。