水蒸气蒸馏与乙醇提取化橘红叶成分的GC-MS分析

韩寒冰，王明阳，刘杰凤，马超，李海航

（1.广东石油化工学院化学与生命科学学院，广东茂名525000；2.茂名出入境检验检疫局，广东茂名525000；3.华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州510631）

水蒸气蒸馏与乙醇提取化橘红叶成分的GC-MS分析

韩寒冰1，王明阳2，刘杰凤1，马超1，李海航3

（1.广东石油化工学院化学与生命科学学院，广东茂名525000；2.茂名出入境检验检疫局，广东茂名525000；3.华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州510631）

分析比较水蒸汽蒸馏法与乙醇提取化橘红叶化学成分的差异。通过水蒸汽蒸馏提取和无水乙醇超声辅助提取化橘红叶中的化学成分，运用GC-MS技术对其成分进行分离鉴定，用峰面积归一化法进行定量分析。水蒸汽蒸馏提取法共分离出58种成分，鉴定出其中的18种，主要成分是：β-蒎烯（19.44%）、β-月桂烯（6.95%）、D-柠檬烯（10.49%）、γ-萜品烯（19.30%）和石竹烯（20.46%）等；乙醇提取法共分离出80种成分，鉴定出其中的43种，主要成分是亚油酸（16.8%）、硬脂酸（6.57%）、菜油甾醇（5.82%）、豆甾烯醇（7.12%）和扶桑甾醇氧化物（14.28%）等，同时鉴定了甲氧基香豆素、补骨脂素、佛手柑内酯、前胡内酯和橙皮油内酯等香豆素类化合物，以及柚皮素、角鲨烯和VE等活性成分。两种不同的提取法共分离鉴定了18种相同的化学成分，乙醇提取法多分离鉴定25种成分。

GC-MS；化橘红叶；水蒸气蒸馏法；乙醇提取法

化橘红为芸香科植物化州柚（Citrus grandis‘Tomentosa’）或柚［Citrus grandis（L.）osbeck］的未成熟果实的外果皮，是治疗风寒咳嗽、健脾消食之常用中药［1-2］。化橘红主要有效成分为黄酮化合物和挥发油，目前，常采用水蒸气蒸馏法［3］、蒸馏萃取法［4］、超临界CO2萃取法［5］和溶剂提取法［6-8］等提取挥发油，但由于水蒸气蒸馏过程中温度高，挥发油成分容易丢失或发生氧化，其他方法原材料也要在50℃～60℃条件下烘干，极易造成挥发油成分中单萜或倍半萜烯类化合物散失或氧化，因此，鉴定的有效成分种类和含量出入较大。本实验采用水蒸气蒸馏法和乙醇提取法对化橘红叶化学成分进行提取，采用GC-MS法对其成分进行分离鉴定，对比两种方法提取的成分和含量的差别，为化橘红叶资源的综合开发利用和质量控制研究提供科学依据。

1材料与仪器

化橘红原植物材料在2012年6月期间采自化州市林尘镇祥秀化橘红实业有限公司生产基地，植株经广东省农业科学院果树研究所向旭研究员鉴定为化州柚（Citrus grandis‘Tomentosa’）的假西洋品种。样品为30天叶龄的嫩叶，鲜材料磨成浆状，经冷冻干燥后，再用研钵磨成粉末作提取用。

岛津GCMS-QP2010plus型气质联用仪：日本岛津公司；XY-FD-8L冷冻干燥机：上海欣谕仪器有限公司；无水乙醇和无水硫酸钠等试剂均为分析纯。

2方法

2.1水蒸汽蒸馏法

称取500g化橘红叶样品粉末，置2000mL圆底烧瓶中，按2010年版中国药典一部附录XD挥发油测定法项下甲法操作［9］，提取5 h，经无水硫酸脱水得到浅黄绿色具浓郁香气透明液体1.2 mL，取挥发油0.5 mL，用无水乙醇定容到5 mL，溶液过0.22 μm滤膜供测试用。

2.2乙醇提取法

准确称取化橘红叶样品粉末1g置10mL的提取管中，加入10mL无水乙醇，在30℃超声提取0.5h，离心，上清液于4℃冰箱中经无水硫酸钠脱水24h，6000r/min低温离心10min，上清液过0.22 μm滤膜供测试用。

2.3气相色谱-质谱条件

HP-5石英毛细管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；升温程序（起始温度50℃，5℃/min升至150℃，8℃/min升至250℃，保持6.5 min）；进样口温度250℃；载气（He）流速1.0 mL/min，进样量0.2 μL；分流比5∶1。E I离子源，电子能量70 eV，扫描范围m/z40～450。NIST 2010标准谱库自动检索，参考有关文献资料，鉴定化学成分，按面积归一化法计算各组分的相对含量。

3结果与讨论

在上述GC-MS色谱-质谱分析条件下，测得叶提取成分GC-MS总离子流色谱图见图1。

图1　水蒸气蒸馏法（A）和乙醇提取法（B）提取成分的总离子流图Fig.1Total ion chromatogram（TIC）of the extracts by steam distillation（A）and ethanol extraction（B）

分析范围在5 min～39 min之间。从气相色谱-质谱总离子流色谱图中，水蒸气蒸馏法提取的挥发油成分中分离出58个色谱峰，鉴定了18个化合物，占总量的90.99%；从乙醇提取法提取的成分中分离出80个色谱峰，鉴定43个化合物，占总量的88.38%。从图1中可以看出，两种提取方法的化学成分的差异很大，具体成分和相对含量分析结果见表1。

表1　水蒸气蒸馏与乙醇提取化橘红叶成分的GC-MS分析Table 1GC-MS analysis of the extracts by steam distillation and ethanol extraction from Citrus Grandis leaves

从表1可以看出，水蒸气蒸馏法提取到的成分绝大部分是低沸点的单萜和倍半萜烯类化合物，主要有β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、γ-萜品烯和石竹烯，它们占分离成分总量的76.64%。乙醇提取法提取得到的化学成分种类多得多，脂肪酸及甾醇物质的含量最高，提取分离鉴定了多种香豆素类化合物、角鲨烯、柚皮素和VE等多种活性物质。

化橘红叶中的主要成分β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、γ-萜品烯和石竹烯等是很好的香料成分，它们均具有祛痰、止咳、驱风、镇痛和杀菌消炎等作用［8］，甲氧基香豆素、补骨脂素、佛手柑内酯和橙皮油内酯等香豆素类化合物具有抗氧化、抗菌抗病毒之功效［10］，柚皮素是柚皮苷的苷元，有研究表明它比柚皮苷具有高得多的活性［11］，角鲨烯和VE均为具有较强生物活性的物质，角鲨烯在血液中输送活性氧的能力很强，VE能抑制脂质过氧化，清除自由基，两者均可增加机体免疫功能，延缓人体衰老，预防和治疗心血管疾病，被广泛应用在医疗保健品和化妆品等方面［12］。化橘红叶片的资源丰富，每年疏枝带来的大量叶片通常作为废物丢弃。因此，深入研究叶的化学成分，对开发利用化橘叶挥发油、化橘红叶保健茶或其它化痰止咳的药用产品，有深远的意义。

实验结果表明，水蒸气蒸馏法只能提取到部分的有效成分，乙醇提取法实验材料用量少，操作过程简单，样品制备耗时少，提取得到的化学成分种类多，同时能最大限度减少挥发油成分的散失、氧化和转化，分析的结果更接近其真实的种类数量和相对含量。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：69

［2］陈志霞，林励.化橘红药材中香豆素类成分的研究［J］.中药材，2004，27（8）：577-578

［3］黄兰珍，林励.化州柚果皮、花、叶有效成分的比较研究［J］.中药新药与临床药理，2008，19（3）：213-216

［4］李春，向能军，沈宏林，等.化橘红挥发油成分分析研究［J］.精细化工中间体，2009，39（4）：65-67

［5］陈连剑，李婷，李成.化橘红超临界CO2萃取物的GC-MS分析［J］.中药材，2003，26（8）：559-560

［6］Han HB，Li H，Hao RL，et al.One-step column chromatographic extraction with gradient elution followed by automatic separation of volatiles，flavonoids and polysaccharides from Citrus grandis［J］. Food Chemistry，2014，145：542-548

［7］陈晓颖，郭晓玲，梁从庆.气相色谱-质谱联用法比较化橘红胎与化橘红皮的脂溶性成分［J］.时珍国医国药，2007，18（2）：371-372

［8］刘涛，谢功昀.柑橘类精油的提取及应用现状［J］.包装与食品机械，2009，27（1）：44-48

［9］国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［M］..北京：中国医药科技出版社，2010：附录181

［10］Mokbel M，Suganuma T.Antioxidant and antimicrobial activities of themethanol extracts from pummelo（Citrus grandis Osbeck）fruit albedotissues［J］.European Food Research and Technology，2006，224（1）：39-47

［11］邓少东，土莲婧，林励，等.UPLC法测定酸水解前后化橘红中四种黄酮类成分的含量［J］.中华中医药杂志，2012，27（4）：924-928

［12］毛多斌，贾春晓，孙晓丽，等.几种功能性植物油中角鲨烯和维生素E分析［J］.中国粮油学报，2007，22（2）：79-82

GC-MS Analysis of the Extracts by Steam Distillation and Ethanol Extraction from Citrus Grandis Leaves

HAN Han-bing1，WANG Ming-yang2，LIU Jie-feng1，MA Chao1，LI Hai-hang3
（1.College of Chemistry and Life Sciences，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China；2.Maoming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Maoming 525000，Guangdong，China；3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development，College of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong，China）

To analyse the chemical constituent of the extracts from leaves of Exocarpium Citrus Grandis by different extraction methods.The compounds were extracted by steam distillation and ethanol separately，constituents were separated and identified by GC-MS，and were quantified by the accuracy of area percent.58 components were separated，among which 18 were identified，the main components were β-Pinene（19.44%），β-Myrcene（6.95%），Limonene（10.49%），γ-Terpinene（19.30%）and Caryophyllene（20.46%）by steam distillation.80 components were separated，among which 43 were identified，the main components were fatty acids（23.27%）and sterols（27.22%），the main active ingredients were five cumarins（Herniarin，Ficusin，Bergapte，Ammidin and Aurapten），Naringenin，Supraene and Vitamin E in the alcohol extraction.18 chemical components of the extracts were the same by the two extraction methods，but there were more than 25 components in the alcohol extraction.

GC-MS；Citrus Grandis leaves；steam distillation；ethanol extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.029

2014-02-21

广东省科技计划项目（2013B020503069）

韩寒冰（1964—），女（汉），教授，硕士研究生，研究方向：天然产物的提取与分离。